As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.
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Artigo de método
Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso de modelos não convencionais para estudar imunidade inata e virulência patógena fornece uma alternativa valiosa aos modelos mamíferos, que podem ser caros e levantar questões éticas. Modelos não convencionais são notoriamente baratos, fáceis de manusear e cultura, e não tomam muito espaço. Eles são geneticamente favoráveis e possuem sequências completas de genoma, e seu uso não apresenta considerações éticas. A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, por exemplo, forneceu grandes insights sobre uma variedade de pesquisas de comportamento, desenvolvimento, metabolismo e imunidade. Mais especificamente, d. melanogaster moscas adultas e larvas possuem várias reações de defesa inatas que são compartilhadas com animais vertebrados. Os mecanismos que regulam as respostas imunológicas têm sido revelados principalmente através de estudos genéticos e moleculares no modelo D. melanogaster . Aqui é fornecida uma nova técnica de injeção larval, que promoverá ainda mais investigações de processos imunológicos inatos em larvas de D. melanogaster e explorará a patogênese de uma ampla gama de infecções microbianas.
Introdução
O melanogaster de Drosophila tem sido imensamente utilizado em pesquisas biológicas e biomédicas por várias décadas, uma vez que o sofisticado conjunto de ferramentas genéticas e moleculares tem evoluído constantemente para análise de uma ampla gama de estudos1,2,3,4. Os aspectos evolutivamente conservados do desenvolvimento, da homeostase e da imunidade inata em D. melanogaster tornaram-no um valioso organismo modelo para estudar várias doenças humanas e insetos5,6....
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Protocolo
1. Criação de moscas
NOTA: O ciclo de vida de D. melanogaster é dividido em quatro estágios: embrião, larva, pupa e adulto. O tempo de geração com condições ideais de criação em laboratório (~25 °C, 60% de umidade e alimento suficiente) é de aproximadamente 10 dias de óvulo fertilizado a adulto fechado. As fêmeas colocam ~100 embriões por dia, e a embriogênese dura cerca de 24 h22. As larvas passam por três estágios de desenvolvimento (instars; L1-L3) em ~4 dias (L1 e L2: 24 h, e L3: 48 h). As primeiras larvas instar começam a se alimentar imediatamente na superfície do meio. Segunda escavação....
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Resultados
Quando realizadas corretamente, as injeções de larvas de D. melanogaster mostram um efeito específico da bactéria. Os dados de sobrevivência foram coletados em vários pontos de tempo após infecções de P. asmbiotica (cepa ATCC43943), E. coli (cepa K12) e PBS (Figura 4). Considerando que as larvas de D. melanogaster são suscetíveis à P. assbiotica, o que compromete a sobrevivência rapidamente, as larvas injetadas com controles E. coli ou PB.......
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Discussão
Drosophila melanogaster está entre os modelos mais valiosos e experimentalmente manipulados usados para investigações de imunidade inata e patogênese de várias infecções microbianas. Isso se deve ao seu ciclo de vida simples e rápido, simples manutenção em um laboratório, genética evolutiva bem estabelecida e diversa caixa de ferramentas genéticas. Métodos anteriores de injeções de larvas D. melanogaster, como o uso de um dispositivo microfluido híbrido ou um micromanipulador narishige, requerem equipam.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington (GWU) pela leitura crítica do manuscrito. GT foi apoiado através de uma bolsa de verão Harlan da GWU. Todas as figuras gráficas foram feitas usando BioRender.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alimento para moscas B (Receita Bloomington) | LabExpress | 7001-NV | Alimento B, em frascos estreitos, 100 frascos/tabuleiro |
| 100 x 15, Placas de Petri mono Totalmente empilháveis | VWR | 25384-342 | Diâmetro 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Placas de Petri mono Totalmente empilháveis | VWR | 25384-092 | Diâmetro 60 x 15 mm |
| Capilares de vidro | VWR | 53440-186 | |
| Grau 1 papel de filtro qualitativo grau padrão, círculo | VWR | 28450-150 | Diâmetro 150 mm |
| Cultura de laboratório Classe II Tipo A2 Gabinete de segurança biológica | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB ágar moleiro em pó 500 g |
| LB Caldo | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB caldo moleiro em pó 500 g |
| Óleo | mineralAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Injetor Programável de Nanolitros | Frascos Estreitos de | 3-000-207 | |
| , Poliestireno | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Agulhas, hipodérmico | VWR | 89219-316 | 22 G, Extrator |
| Micropipetas de Próxima Geração | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Comprimidos PBS de grau biotecnológico 200tab |
| Prism | GraphPad | Versão 8 | |
| Seringas - plástico, descartável | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
Referências
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ame....
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Reimpressões e permissões
