Drosophila melanogaster Protokol til injektion af larve
Summary
Drosophila melanogaster voksne fluer er blevet flittigt brugt som modelorganismer til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for værts antimikrobielle medfødte immunresponser og mikrobielle infektionsstrategier. For at fremme D. melanogaster larvestadiet som et yderligere eller alternativt modelsystem beskrives en larveinjektionsteknik.
Abstract
Brugen af ukonventionelle modeller til at studere medfødt immunitet og patogen virulens giver et værdifuldt alternativ til pattedyrsmodeller, som kan være dyre og rejse etiske spørgsmål. Ukonventionelle modeller er notorisk billige, nemme at håndtere og kultur og tager ikke meget plads. De er genetisk modtagelige og besidder komplette genomsekvenser, og deres anvendelse giver ingen etiske overvejelser. Bananfluen Drosophila melanogaster har for eksempel givet stor indsigt i en række adfærd, udvikling, stofskifte og immunitetsforskning. Mere specifikt har D. melanogaster voksne fluer og larver flere medfødte forsvarsreaktioner, der deles med hvirveldyr. De mekanismer, der regulerer immunresponser, er for det meste blevet afsløret gennem genetiske og molekylære undersøgelser i D. melanogaster-modellen . Her tilvejebringes en ny larveinjektionsteknik, som yderligere vil fremme undersøgelser af medfødte immunprocesser i D. melanogasterlarver og udforske patogenesen af en lang række mikrobielle infektioner.
Introduction
Drosophila melanogaster er blevet enormt udnyttet i biologisk og biomedicinsk forskning i flere årtier, da det sofistikerede udvalg af genetiske og molekylære værktøjer støt har udviklet sig til analyse af en bred vifte af undersøgelser1,2,3,4. De evolutionært bevarede aspekter af udvikling, homeostase og medfødt immunitet i D. melanogaster har gjort det til en værdifuld modelorganisme til at studere forskellige sygdomme hos mennesker og insekter5,6. Især er den grundlæggende rolle, som D. melanogaster-modellen spiller for at studere immunitet, stort set blevet eksemplificeret i voksne fluestudier. D. melanogaster larver undersøgelser har imidlertid også bidraget til den nuværende viden og hovedsageligt udforsket cellulære immunresponser, specifikt for hvepse- og nematodeinfektioner, der forekommer gennem insektets kutikle7,8,9,10. Drosophila melanogaster larver besidder tre forskellige typer blodlegemer, samlet kaldet hæmocytter: plasmatocytter, krystalceller og lamellocytter11,12,13. Disse celler kan montere en række immunresponser, når D. melanogaster larver er inficeret med patogener som bakterier, svampe, vira og parasitter14,15,16. Cellulære immunresponser omfatter direkte opslugning (fagocytose) af små molekyler eller bakterier, melanisering, indkapsling af større patogener såsom parasitoide æg og produktion af reaktive iltarter (ROS) og nitrogenoxidsyntaser (NOS) 17,18,19.
I modsætning hertil er der offentliggjort færre undersøgelser om brugen af D. melanogaster larvemodellen til at analysere humorale immunresponser. Dette skyldes hovedsagelig anvendelsen af fodringsassays til oral infektion af D. melanogasterlarver og flere udfordringer forbundet med mikroinjektion af larver, herunder præcis håndtering af larver og korrekt brug af mikronålen, især under penetration20,21. Således har den begrænsede viden om larveinfektion og tekniske vanskeligheder (dvs. høj dødelighed) ofte gjort D. melanogaster larvemodellen vanskelig at bruge. En larvemodel vil have potentiale til at identificere nye molekylære mekanismer, der vil give yderligere indsigt i værtspatogeninteraktioner og induktion af specifikke værts medfødte immunresponser mod patogene infektioner.
Her beskrives en enkel og effektiv protokol, der kan bruges til at injicere D. melanogaster larver med forskellige patogener, såsom bakterier, detaljeret. Især anvendes D. melanogaster larver til injektioner med det humane patogen Photorhabdus asymbiotica og de ikke-patogene bakterier Escherichia coli. Denne metode kan anvendes til manipulation og analyse af D. melanogasters immunrespons på forskellige mikrobielle infektioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster er blandt de mest værdifulde, eksperimentelt manipulerede modeller, der anvendes til undersøgelser af medfødt immunitet og patogenese af forskellige mikrobielle infektioner. Dette skyldes dets enkle og hurtige livscyklus, enkel vedligeholdelse i et laboratorium, veletableret evolutionær genetik og forskelligartet genetisk værktøjskasse. Tidligere metoder til D. melanogaster larver injektioner, såsom at bruge en hybrid mikrofluidisk enhed eller en Narishige micromanipulator…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University (GWU) for kritisk læsning af manuskriptet. GT blev støttet gennem et Harlan sommerstipendium fra GWU. Alle grafiske figurer blev lavet ved hjælp af BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
Referências
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genética. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
