DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

Summary

DNA 리간드를 이용한 ATP 의존형 크로마틴 리모델링기의 상호 작용은 CD 분광법을 사용하여 설명된다. 생성된 봉우리에 의해 분석된 유전자 프로모터에 대한 유도된 변형 변화는 전사 조절의 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있다.

Abstract

원형 이색성 (CD) 분광법은 생체 분자의 이차 구조 및 상호 작용을 조사하는 간단하고 편리한 방법입니다. CD 분광기의 최근 발전은 생체 내 전사 조절에 대한 이해를 위해 다양한 미세 환경에서 DNA 단백질 상호 작용 및 변형 역학에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 잠재적인 전사 영역 주위 영역이 전사가 발생하기 위해 풀려나야 합니다. 이것은 히스톤 수정, DNA에 전사 인자의 결합 및 기타 크로마틴 리모델링 활동의 조정을 요구하는 복잡한 과정입니다. CD 분광학을 사용하여 ATP 의존 성 크로마틴 리모델링기와 같은 규제 단백질에 의한 프로모터 영역의 형성 적 변화를 연구하여 전사를 촉진할 수 있습니다. 단백질에서 발생하는 형성 적 변화는 또한 모니터링 될 수있다. 또한, 표적 DNA를 향한 단백질의 친화성 및 서열 특이성에 관한 질의는 표적 DNA에 돌연변이를 통합하여 해결할 수 있다. 요컨대, 이 민감하고 저렴한 방법의 고유 한 이해는 크로마틴 역학의 변화를 예측하여 전사 조절의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

Introduction

원형 이색성(CD)은 오른손잡이와 왼손잡이 원형 편광광의 차동 흡수로 이어지는 생물학적 거대 분자의 고유치랄성에 의존하는 분광 기술입니다. 이 차동 흡수는 원형 이분해증으로 알려져 있습니다. 따라서 이 기술은 단백질 및 DNA와 같은 생물학적 거대 분자의 형성을 묘사하는 데 사용될 수 있으며, 둘 다 키^{랄 센터를 포함1,2}.

전자파에는 전기 및 자기 구성 요소가 모두 포함되어 있습니다. 전기및 자기장은 모두 파도 전파 방향에 수직으로 진동합니다. 편광되지 않은 빛의 경우, 이 필드는 여러 방향으로 진동합니다. 빛이 원형으로 편광되면 두 개의 전자기장이 서로 90° 위상 차이로 얻어집니다. 키랄 분자는 원형 광학 회전(birefringence)을 보여 주어 오른손잡이 원형 편광광과 왼손잡이 원형 편광광을 다른 범위3로 ^{흡수합니다.} 결과 전기장은 파장의 함수인 타원으로 추적됩니다. 따라서 CD 스펙트럼은 타원형(q)으로 기록되며, 데이터는 파장의 함수로서 평균 잔류물 타원형으로 제시된다.

단백질의 경우, 아미노산의 Cα(글리신 제외)는 치랄이며, 이는 이러한 거대 분자⁴의 이차 구조를 결정하기 위해 CD 분광법에 의해 이용된다. 단백질 분자의 CD 스펙트럼은 전형적으로 극UV 범위에서 기록됩니다. α-헬리칼 단백질은 222nm와 208nm에서 2개의 네거티브 밴드와 193 ^nm4에서 1개의 긍정적인 피크를 가지고 있습니다. 항병렬 β 시트 이차 구조를 가진 단백질은 218 nm에서 음수 피크와 195 ^nm4에서 양수 피크를 보여줍니다. 무질서한 구조물을 가진 단백질은 210 nm 의 가까운 낮은 타원형및 195 ^nm4에서 음성 피크를 보여줍니다. 따라서, 상이한 이차 구조물을 위한 잘 정의된 피크/대역은 CD를 데만리간 결합뿐만 아니라 데칭 하는 동안 단백질의 이차 구조에서 발생하는 형태 변화를 해명하는 편리한 도구이다.

핵산에는 설탕 분자, 이차 구조의 헬리콥터, 환경에서 DNA의 장거리 삼차 순서의 세 가지 소스가 ^{있습니다5,6}. 핵산의 CD 스펙트럼은 전형적으로 190 nm 범위에서 기록된다^5,6. 단백질과 마찬가지로 DNA의 각 형태는 특징적인 스펙트럼을 제공하지만 피크/밴드는 용매 조건 및 DNA 서열의 차이로 인해 다소 다양할 수 있습니다⁷. B-DNA, 가장 일반적인 형태, 주위 긍정적인 피크 주위 260-280 nm와 주위 부정적인 피크 245 ^nm6 특징. B형 DNA의 피크/밴드는 일반적으로 작기 때문에 기본 쌍은 이중 나선에 수직이되어 분자에 약한 키랄성을 부여합니다. A-DNA는 260 nm에서 지배적 인 긍정적 인 피크와 210 ^nm6 주위에 음수 피크를 제공합니다. 왼손잡이 나선 인 Z-DNA는 290 nm에서 음수 밴드와 260 ^nm6 정도의 긍정적 인 피크를 제공합니다. 이 DNA는 또한 205 ^nm6에서 극단적으로 부정적인 피크를 줍니다.

이러한 적합성 외에도 DNA는 트리플엑스, 쿼드러플렉스 및 헤어핀을 형성할 수 있으며, 이 모든 것은 CD 분광학으로 구별될 수 있습니다. 평행 G 쿼드러플렉스는 260nm에서 지배적인 포지티브 밴드를 제공하며, 반병렬 G-쿼드루플렉스는 260nm에서 음수 대역과 290nm의 양수 피크를 제공하므로 두 형태의 쿼드러플렉스 구조를 쉽게 구별할 수 있습니다⁶. 트리플렉스는 특징적인 스펙트럼을 제공하지 않습니다⁸. 예를 들어, Na⁺ 의 존재에서 G.G.C 및 T.A.T 염기 쌍을 포함하는 분자 내 삼중 나선을 형성할 수 있는 잠재력을 가진 36개의 뉴클레오티드 길이 DNA의 스펙트럼은 240 nm및 넓은 양성 피크에서 강한 음수 대역을 나타낸다. 광범위한 긍정적 인 피크는 266, 273 및 286 nm의 기여를 보여줍니다. Na⁺ 및 Zn⁺ 의 존재에 동일한 올리고뉴클레오티드는 네 개의 네 개의 네거티브 밴드 (213, 238, 266 및 282 nm)와 258 nm에서 긍정적 인 피크를 보여줍니다. 따라서, 트리플렉스 DNA의 스펙트럼은 염조건에 따라 달라질 수 있다⁸.

이러한 적합성 외에도 CD 스펙트럼은 X-DNA라는 또 다른 형태의 DNA를 식별할 수 있게 되었습니다. X-DNA는 DNA 서열에 대체 아데닌 및 티민 잔류물이 포함될 때 형성됩니다. X-DNA의 CD 스펙트럼은 250 및 280 nm에서 두 개의 네거티브 피크를 포함합니다. 아주 작은 정보는 X-DNA에 관하여 유효합니다, 긍정적인 supercoiling6,9를 위한 싱크로 작동하기 위하여 추측되고 있더라도. CD 스펙트럼의 변화는 또한 리간드 단백질 상호 작용에 대한 세부 사항을 밝힐 수 있고, 그러므로, 약물 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분자 방법의 무기고에 추가되었습니다10,11,12,13,14. CD 스펙트럼은 또한 접이식 과정 동안 단백질의 이차 구조의 변화를 모니터링하는 데 사용되어 왔다¹⁵. 유사하게, CD 스펙트럼은 또한 리간드 DNA 상호 작용을 탐구하기 위해 사용될 수 있습니다^16,17.

따라서 CD 분광학은 저렴하지 않은 장비 및 소프트웨어에 대한 액세스가 제공되므로 다양한 형태의 DNA 형태를 구별하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 이 방법은 매우 민감하고 빠를 수 있습니다. 소량의 DNA만 필요하므로 핵 자기 공명(NMR) 분광법의 대체 기술에 우위를 부여합니다. 리간드 및 기판의 적정도 쉽게 수행할 수 있습니다. 주요 제약 조건은 DNA가 매우 순수해야한다는 것입니다. 폴리아크릴아미드 젤 전기포고증(PAGE)-정제 DNA를 사용하는 것이 좋습니다.

CD 스펙트럼에 의해 얻은 정보는 주로 단백질 구조적 특징을 추론하고 뚜렷한 DNA 순응자를 식별하는 데 사용되었습니다. 본 연구에서, CD 스펙트럼은 관심/예측 전사 인자의 단백질이 그 이펙터 유전자의 프로모터 영역에서 형성 변화를 가져올 수 있는지 여부를 규명하기 위해 생체 내 크로마티면역 침전(ChIP) 실험에서 얻은 결과를 통합하는 데 사용되어 왔다. 이러한 협업은 프로모터의 전사 시작 부위(TSS) 전후에 예측된 전사 계수에 의한 전사 조절 메커니즘을 예측함으로써 전통적인 CD 분광 기술의 진행을 지원합니다.

크로마티닌 리모델링은 전사 인자, DNA 복제 성분 또는 손상 수리 단백질과 같은 다양한 조절 요인에 단단히 포장된 크로마틴을 가능하게 함으로써 DNA 대사 과정을 조절하는 것으로 알려진 잘 정의된 메커니즘이다. 또한 단백질의 SWI/SNF 가족으로 알려진 ATP 의존적인 크로마틴 리모델링제는 진핵 세포에 존재하는 주요 리모델링 단백질^18,19입니다. 필로유전 적 클러스터링은 SWI/SNF 단백질 제품군을 6하위 그룹으로 분류했습니다^: Snf2 유사, Swr1 유사, SSO1653 유사, Rad54 유사, Rad5/16 유사, 먼. SMARCAL1, 이 연구에 관심있는 단백질, 먼 하위 그룹에 속^한다20. 이 단백질은 CD 분광법을 사용하여 전사 조절의 그것의 모드를 조사하기 위하여 이용되었습니다.

ATP 의존형 크로마틴 리모델링 단백질의 대부분의 구성원은 ATP 의존식 방식으로 뉴클레오좀을 재배치하거나 퇴거시키거나 히스톤 변이체 교환을 중재하는 것으로 나타났다^21,22. 그러나, 이 가족의 몇몇 일원은 뉴클레오좀, 예를 들면, SMARCAL1를 리모델링하기 위하여 나타나지 않았습니다. 비록 연구 SMARCAL1 폴리텐 염색체와 연결, 뉴 클레 오 좀 을 리모델링 하는 능력에 관한 실험적인 증거는 부족 ²³. 따라서, SMARCAL1은 ^DNA24의 변형을 변경하여 전사를 조절할 수 있다고 가정하였다. CD 분광법은 이 가설을 검증하는 쉽고 접근 가능한 방법을 제공했습니다.

SMARCAL1은 ATP 의존성 크로마틴 리모델링 단백질로, 주로 아닐링 헬리케이스^25,26,27로 기능합니다. DNA 형성을 리모델링하여 전사를 조절하도록 가정하였다²⁴. 이러한 가설을 시험하기 위해 독소루비신 유발 DNA 손상 중 유전자 전사 조절에서 SMARCAL1의 역할이 연구되었다. 이러한 연구에서, SMARCAL1 생체 내 분석 및 ADAAD에서 체외 분석에 대 한 사용 되었다^28,29. 이전 연구는 ADAAD구조 의존적이지만 서열 독립적 인 방식으로 DNA를 인식 할 수 있음을 보여 주었다^30,31. 단백질은 줄기 루프 DNA와 유사한 단일 가닥 전이 지구에 이중 가닥을 소유한 DNA 분자에 최적으로 결합하고, ATP ^30,31을 가수분해합니다.

생체 내 실험에서 SMARCAL1은 프로모터 영역에 결합하여 MYC, DROSHA, DGCR8 및 DICER의 발현을 조절하는 것으로 나타났다^28,29. 상호 작용영역은 ChIP 실험^28,29에 의해 확인되었다. ChIP 기술은 세포 내의 cognate DNA를 가진 단백질의 상호 작용을 분석하기 위하여 이용됩니다. 그것의 목표는 프로모터 또는 그밖 DNA 결합 사이트에 전사 요인과 같은 특정 단백질이 특정 게놈 지역에 묶는지 결정하는 것입니다. DNA에 결합된 단백질은 포름알데히드를 사용하여 처음으로 교차 연결됩니다. 그 다음에는 크로마틴의 격리가 뒤따릅니다. 분리된 크로마틴은 초음파 처리 또는 핵소화에 의해 500bp 단편으로 전염되고, DNA에 결합된 단백질은 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 면역침전화된다. 교차 연결은 반전되고, DNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 분석된다.

ChIP 결과는 SMARCAL1이 이 유전자의 발기인 지구에 있는 형성 변경을 유도해서 전사 적 규정을 중화할 가능성이 있다는 가설로 이끌어 냈습니다. QGRS 매퍼 및 Mfold 소프트웨어는 이러한 프로모터 영역의 잠재력을 식별하여 이차 구조를 형성하는 데 사용되었습니다^28,29. QGRS 매퍼는 G-쿼드러플렉스³²를 예측하는 데 사용되며 ^Mfold33은 서열의 능력을 분석하여 줄기 루프와 같은 보조 구조를 형성합니다.

이차 구조 분석 후, 추가 체외 실험은 재조합 6X 그의 태그활성 DNA 의존ATPase A 도메인(ADAAD), SMARCAL1의 소 호모로, 에스케리치아 대장균³⁴로부터 정제하였다. ATPase assays는 확인된 DNA 순서가 effectors28,29로 작동할 수 있다는 것을 확립하기 위하여 ADAAD를 사용하여 수행되었습니다. 마지막으로, CD 분광법은 ADAAD28,29에 의해 DNA 분자에서 유도된 형성적 변화를 모니터링하기 위해 수행되었다.

단백질의 ATPase 활성이 DNA 분자의 형태 변화를 유도하는 데 필수적이었다는 것을 증명하기 위해, 에틸렌디아민 테트라아세아세트산(EDTA)을 Mg⁺² 또는 활성 DNA 의존성 ATPase 도메인 억제제 네오마이신(ADAADiN)에 첨가하였으며, SWI/SNF 단백질의 특정 억제제, ^{3655추가되었다.} . 이러한 CD 분광 기술은 ChIP 또는 다른 관련 분석체가 프로모터의 예측된 게놈 영역에 결합하기 위해 입증된 정제된 단백질과 함께 활용할 수 있다.

Protocol

1. 반응 성분의 작동 농도 CD 및 기타 반응 구성 요소에 대한 버퍼의 작업 농도를 신선하게 준비( 표 1 참조)하고 반응을 설정하기 전에 4°C에서 유지합니다.참고: 본 논문에 기재된 CD 반응의 경우, 성분의 작동 농도는 다음과 같습니다: 나트륨 인산염 버퍼(pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, 단백질 1 μM, MgCl2 10mMM, EDTA 50mM, ADAADiN 5 μM. …

Representative Results

ADAAD는 MYC 프로모터의 구조와 같은 줄기 루프를 안정화시합니다.이전 실험 증거는 SMARCAL1MYC29의 부정적인 레귤레이터는 것으로 나타났습니다. QGRS 매퍼에 의한 MYC 유전자의 159bp 장기 프로모터 영역을 분석한 결과, 전방 가닥이 G-쿼드러플렉스(표 2)를 형성할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었다. Mfo…

Discussion

이 문서의 목적은 ATP 의존 염색질 리모델링 단백질의 존재에 DNA에서 발생하는 형성 변화를 연구하고 유전자 발현에 이러한 형태 변화를 연결하는 접근법으로 CD 분광법을 도입하는 것입니다. CD 분광법은 DNA의 형성 변화를 연구하는 빠르고 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제공합니다.

이 기술에 대 한 고려 될 중요 한 포인트는 DNA와 단백질의 순도. DNA와 단백질이 모두 >95% ?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500