CD-spektroskopi for å studere DNA-proteininteraksjoner

Summary

Samspillet mellom en ATP-avhengig kromatinremodeler med en DNA-ligand er beskrevet ved hjelp av CD-spektroskopi. De induserte konformasjonsendringene på en genpromotor analysert av toppene som genereres, kan brukes til å forstå mekanismen for transkripsjonsregulering.

Abstract

Sirkulær dikroisme (CD) spektroskopi er en enkel og praktisk metode for å undersøke sekundærstrukturen og interaksjonene til biomolekyler. Nylige fremskritt innen CD-spektroskopi har gjort det mulig å studere DNA-proteininteraksjoner og konformasjonsdynamikk av DNA i ulike mikromiljø i detalj for en bedre forståelse av transkripsjonsregulering in vivo. Området rundt en potensiell transkripsjonssone må vikles ut for at transkripsjon skal skje. Dette er en kompleks prosess som krever koordinering av histone modifikasjoner, binding av transkripsjonsfaktoren til DNA, og andre kromatin ombyggingsaktiviteter. Ved hjelp av CD-spektroskopi er det mulig å studere konformasjonsendringer i promotorregionen forårsaket av regulatoriske proteiner, for eksempel ATP-avhengige kromatinremodelere, for å fremme transkripsjon. Konformasjonsendringene som forekommer i proteinet kan også overvåkes. I tillegg kan spørsmål om proteinets affinitet mot målets DNA og sekvensspesifikkhet løses ved å inkorporere mutasjoner i mål-DNA-et. Kort sagt, den unike forståelsen av denne sensitive og rimelige metoden kan forutsi endringer i kromatindynamikk, og dermed forbedre forståelsen av transkripsjonsregulering.

Introduction

Sirkulær dikroisme (CD) er en spektroskopisk teknikk som er avhengig av den iboende chiraliteten til biologiske makromolekyler som fører til differensialabsorpsjon av høyrehendt og venstrehendt sirkulært polarisert lys. Denne differensialabsorpsjonen er kjent som sirkulær dikroisme. Teknikken kan derfor brukes til å avgrense konformasjonen av biologiske makromolekyler, som proteiner og DNA, som begge inneholder kirale ^sentre1,2.

Elektromagnetiske bølger inneholder både elektriske og magnetiske komponenter. Både de elektriske og magnetfeltene svinger vinkelrett på bølgeforplantningsretningen. Når det gjelder uppolarisert lys, svinger disse feltene i mange retninger. Når lyset polariseres sirkulært, oppnås to elektromagnetiske felt ved 90° faseforskjell til hverandre. Kirale molekyler viser sirkulær optisk rotasjon (birefringence) slik at de vil absorbere høyrehendt sirkulært polarisert lys og venstrehånds sirkulært polarisert lys i forskjellige ^omfang3. Det resulterende elektriske feltet vil bli sporet som en ellipse, en funksjon av bølgelengden. CD-spekteret er dermed registrert som elliptikk (q), og dataene presenteres som Mean Residue Ellipticity som en funksjon av bølgelengde.

Når det gjelder proteiner, er Cα av aminosyrer (unntatt glycin) chiral, og dette utnyttes av CD-spektroskopi for å bestemme den sekundære strukturen til denne ^{makromolekylen4}. CD-spektraet av proteinmolekyler registreres vanligvis i Fjern UV-serien. α-spiralformede proteiner har to negative bånd på 222 nm og 208 nm og en positiv topp på 193 ^NM4. Proteiner med anti-parallell β-arks sekundær struktur viser en negativ topp på 218 nm og en positiv topp på 195 ^nm4. Proteiner med uordnede strukturer viser lav elliptikk nær 210 nm og en negativ topp på 195 ^nm4. Dermed gjør den veldefinerte toppen / båndene for forskjellige sekundære strukturer CD til et praktisk verktøy for å belyse konformasjonsendringene som forekommer i proteinens sekundære struktur under denaturering samt ligandbinding.

Nukleinsyrer har tre kilder til chiralitet: sukkermolekylet, mykheten til sekundærstrukturen og den langtrekkende tertiære bestillingen av DNA i ^miljøet5,6. CD-spektra av nukleinsyrer registreres vanligvis i området 190 til 300 nm, ^5,6. Hver konformasjon av DNA, akkurat som proteiner, gir et karakteristisk spektrum, selv om toppene / båndene kan variere i noen grader på grunn av løsningsmiddelforhold og forskjeller i DNA-sekvenser7. B-DNA, den vanligste formen, er preget av en positiv topp rundt 260-280 nm og en negativ topp rundt 245 ^nm6. Toppene/båndene til B-form DNA er generelt små fordi baseparene er vinkelrett på den doble helixen, og gir svak chiralitet til molekylet. A-DNA gir en dominerende positiv topp på 260 nm og en negativ topp rundt 210 ^nm6. Z-DNA, den venstrehendte helixen, gir et negativt bånd på 290 nm og en positiv topp rundt 260 ^nm6. Dette DNA-et gir også en ekstremt negativ topp på 205 ^nm6.

I tillegg til disse konformasjonene kan DNA også danne triplexer, quadruplexes og hårnåler, som alle kan preges av CD-spektroskopi. Den parallelle G-quadruplex gir et dominerende positivt bånd på 260 nm, mens den anti-parallelle G-quadruplex gir et negativt bånd på 260 nm og en positiv topp på 290 nm, noe som gjør det enkelt å skille mellom de to former for quadruplex ^strukturer6. Triplexes gir ikke et karakteristisk ^spektrum8. For eksempel viser spektraet til et 36 nukleotidlangt DNA med potensial til å danne en intramolekylær trippelhelix som inneholder G.G.C og T.A.T basepar i nærvær av Na ⁺ et sterkt negativt bånd på 240 nm og en bred positiv topp. Den brede positive toppen viser bidrag på 266, 273 og 286 nm. Det samme oligonukleotidet i nærvær av Na⁺ og Zn⁺ viser fire negative bånd (213, 238, 266 og 282 nm) og en positiv topp på 258 nm. Dermed kan spektra av triplex DNA variere avhengig av ^saltforhold8.

I tillegg til disse konformasjonene har CD-spektra gjort det mulig å identifisere en annen form for DNA kalt X-DNA. X-DNA dannes når DNA-sekvensen inneholder alternative adenin- og tyminrester. CD-spektraet til X-DNA inneholder to negative topper på 250 og 280 nm. Svært lite informasjon er tilgjengelig om X-DNA, selv om det har blitt spekulert i å fungere som en vask for positiv supercoiling6,9. Endringer i CD-spektra kan også avsløre detaljer om ligandproteininteraksjoner og har derfor blitt lagt til arsenalet av molekylære metoder for å oppdage legemiddelproteininteraksjoner10,11,12,13,14. CD-spektra har også blitt brukt til å overvåke endringene i den sekundære strukturen av proteiner under ^{foldeprosessen15}. På samme måte kan CD-spektra også brukes til å undersøke ligand-DNA-interaksjoner16,17.

CD-spektroskopi er derfor en enkel, billig metode for å skille mellom de forskjellige formene for DNA-konformasjon, forutsatt at det er tilgang til ikke-så billig utstyr og programvare. Metoden er svært følsom og rask. Det krever bare en liten mengde DNA, noe som gir det en fordel over den alternative teknikken for kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Titrasjoner med ligander og substrater er også enkle å utføre. Den største begrensningen er at DNA-et skal være svært rent. Det anbefales å bruke polyakrylamid gel elektroforese (PAGE)-renset DNA.

Informasjonen innhentet av CD-spektra har hovedsakelig blitt brukt til å utlede proteinstrukturelle egenskaper og for å identifisere distinkte DNA-konforme. I denne studien har CD-spektra blitt brukt til å integrere resultatene oppnådd fra et in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) eksperiment for å avgrense om proteinet av interesse / anslått transkripsjonsfaktor kan føre til en konformasjonsendring i promotorområdet av effektorgenene. Dette samarbeidet bidrar til å utvikle tradisjonelle CD-spektroskopiske teknikker ved å forutsi mekanismen for transkripsjonsregulering ved den anslåtte transkripsjonsfaktoren på og rundt transkripsjonsstartstedet (TSS) til en promotør.

Kromatin ombygging er en veldefinert mekanisme som er kjent for å regulere DNA-metabolske prosesser ved å gjøre det tettpakkede kromatin tilgjengelig for ulike regulatoriske faktorer som transkripsjonsfaktorer, komponenter av DNA-replikasjon eller skadereparasjonsproteiner. De ATP-avhengige kromatinremodelerne, også kjent som SWI/SNF-familien av proteiner, er viktige remodelerproteiner tilstede i eukaryote ^celler18,19. Fylogenetisk klynging har kategorisert SWI/SNF-familien av proteiner i 6 ^{undergrupper20}: Snf2-lignende, Swr1-lignende, SSO1653-lignende, Rad54-lignende, Rad5/16-lignende og fjern. SMARCAL1, proteinet av interesse i denne studien, tilhører den fjerne ^{undergruppen20}. Dette proteinet har blitt brukt til å undersøke sin modus for transkripsjonsregulering ved hjelp av CD-spektroskopi.

De fleste medlemmene av de ATP-avhengige kromatinoppussingsproteinene har vist seg å enten omplassere eller kaste ut nukleosomer eller formidle histonevariantutveksling på en ATP-avhengig ^måte21,22. Noen medlemmer av denne familien har imidlertid ikke vist seg å ombygge nukleosomer, for eksempel SMARCAL1. Selv om studier har vist at SMARCAL1 forbinder med polytene kromosomer, mangler eksperimentelle bevis angående dens evne til å ombygge ^{nukleosomer23}. Derfor ble det postulert at SMARCAL1 kan regulere transkripsjon ved å endre samsvaret med ^DNA24. CD-spektroskopi ga en enkel og tilgjengelig metode for å validere denne hypotesen.

SMARCAL1 er et ATP-avhengig kromatinoppussingsprotein som primært fungerer som en glødende helicase25,26,27. Det har blitt postulert for å modulere transkripsjon ved å ombygge DNA-konformasjonen24. For å teste denne hypotesen ble SMARCAL1s rolle i regulering av gentranskripsjon under doksorubicinindusert DNA-skade studert. I disse studiene ble SMARCAL1 brukt til in vivo-analyse og ADAAD for in vitro-analyser28,29. Tidligere studier har vist at ADAAD kan gjenkjenne DNA på en strukturavhengig, men sekvensuavhengig ^måte30,31. Proteinet binder seg optimalt til DNA-molekyler som har dobbelstreng til overgangsregioner med én tråd, i likhet med stammesløyfe-DNA, og hydrolyserer ATP ^30,31.

In vivo-eksperimenter viste at SMARCAL1 regulerer uttrykket av MYC, DROSHA, DGCR8 og DICER ved å binde seg til promotorregionene28,29. Samhandlingsområdet ble identifisert av ChIP-eksperimenter28,29. ChIP-teknikken brukes til å analysere samspillet mellom et protein og dets cognate DNA i cellen. Målet er å avgjøre om spesifikke proteiner, for eksempel transkripsjonsfaktorer på promotører eller andre DNA-bindende nettsteder, er bundet til spesifikke genomiske områder. Proteinet bundet til DNA er først kryssbundet ved hjelp av formaldehyd. Dette etterfølges av isolasjon av kromatin. Det isolerte kromatinet skjæres til 500 bp fragmenter enten ved sonikering eller nuklease fordøyelse, og proteinet bundet til DNA er immunoprecipitated ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for proteinet. Krysskoblingen reverseres, og DNA-et analyseres enten ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) eller kvantitativ sanntids-PCR.

ChIP-resultatene førte til hypotesen om at SMARCAL1 muligens formidler transkripsjonsregulering ved å indusere en konformasjonsendring i promotorregionene til disse genene. QGRS-tilordning og Mfold-programvare ble brukt til å identifisere potensialet i disse promotorområdene for å danne sekundære ^{strukturer28,29}. QGRS-tilordning brukes til å forutsi G-quadruplexes32, mens ^Mfold33 analyserer en sekvenss evne til å danne sekundære strukturer som stamceller.

Etter sekundær strukturanalyse ble ytterligere in vitro-eksperimenter utført med rekombinant 6X Hans-taggede Aktive DNA-avhengige ATPase A Domain (ADAAD), den bovine homologen til SMARCAL1, renset fra Escherichia coli34. ATPase-analyser ble utført ved hjelp av ADAAD for å fastslå at de identifiserte DNA-sekvensene kunne fungere som ^{effektorer28,29}. Til slutt ble CD-spektroskopi utført for å overvåke konformasjonsendringene som ble indusert i DNA-molekylet av ^ADAAD28,29.

For å bevise at ATPase-aktiviteten til proteinet var avgjørende for å indusere en konformasjonsendring i DNA-molekylet, ble enten etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) tilsatt til chelate Mg⁺² eller Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), en spesifikk hemmer av SWI/SNF-proteinet, ble tilsatt35,36 . Denne CD-spektroskopiske teknikken kan brukes med ethvert renset protein som har blitt demonstrert av ChIP eller en annen relevant analyse for å binde seg til en predikert genomisk region av en promotor.

Protocol

1. Arbeidskonsentrasjon av reaksjonskomponentene Forbered arbeidskonsentrasjonene av buffere for CD og andre reaksjonskomponenter ferskt (se tabell 1) og hold dem ved 4 °C før du setter opp reaksjonene.MERK: For CD-reaksjonene som er beskrevet i dette dokumentet, er arbeidskonsentrasjonene av komponenter som følger: Natriumfosfatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM. <s…

Representative Results

ADAAD stabiliserer en stamme-loop som struktur på MYC-promotorenTidligere eksperimentelle bevis viste at SMARCAL1 er en negativ regulator av MYC29. Analyse av den 159 bp lange promotorregionen av MYC-genet av QGRS-tilordning viste at fremoverstrengen hadde potensial til å danne en G-quadruplex (tabell 2). Mfold viste at begge trådene i MYC DNA kunne danne en stamme-loop-lignende struktur…

Discussion

Hensikten med denne artikkelen er å introdusere CD-spektroskopiteknikken som en tilnærming for å studere konformasjonsendringene som forekommer i DNA i nærvær av ATP-avhengige kromatinoppussingsproteiner og å koble disse konformasjonsendringene til genuttrykk. CD-spektroskopi gir en rask og lett tilgjengelig metode for å studere konformasjonsendringene i DNA.

Et avgjørende poeng å vurdere for denne teknikken er renheten til DNA og protein. Det anbefales å sikre at både DNA o…

Materials

2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500