Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

Summary

A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Abstract

A espectroscopia do dicromaísmo circular (CD) é um método simples e conveniente para investigar a estrutura secundária e as interações das biomoléculas. Os recentes avanços na espectroscopia de CD permitiram o estudo das interações DNA-proteína e da dinâmica conformacional do DNA em diferentes microambientes em detalhes para uma melhor compreensão da regulação transcricional in vivo. A área ao redor de uma zona de transcrição em potencial precisa ser desenrolada para que a transcrição ocorra. Trata-se de um processo complexo que requer a coordenação de modificações de histona, vinculação do fator de transcrição ao DNA e outras atividades de remodelação da cromatina. Utilizando espectroscopia de CD, é possível estudar mudanças conformais na região promotora causadas por proteínas regulatórias, como remodeladores de cromatina dependentes de ATP, para promover a transcrição. As alterações conformais que ocorrem na proteína também podem ser monitoradas. Além disso, consultas sobre a afinidade da proteína com seu DNA alvo e especificidade de sequência podem ser abordadas incorporando mutações no DNA alvo. Em suma, a compreensão única desse método sensível e barato pode prever mudanças na dinâmica da cromatina, melhorando assim a compreensão da regulação transcricional.

Introduction

O dichroismo circular (CD) é uma técnica espectroscópica que se baseia na quiralidade inerente das macromoléculas biológicas que leva à absorção diferencial da luz circularmente polarizada destro e canhoto. Essa absorção diferencial é conhecida como dicromaísmo circular. A técnica, portanto, pode ser utilizada para delinear a conformação de macromoléculas biológicas, como proteínas e DNA, ambas contendo centros ^quirais1,2.

As ondas eletromagnéticas contêm componentes elétricos e magnéticos. Tanto os campos elétricos quanto os magnéticos oscilam perpendiculares à direção da propagação de ondas. No caso da luz não polarizada, esses campos oscilam em muitas direções. Quando a luz é polarizada circularmente, dois campos eletromagnéticos são obtidos a 90° diferença de fase um para o outro. As moléculas quirais mostram rotação óptica circular (birefringência) de tal forma que absorverão a luz circularmente polarizada e a luz circularmente polarizada com mão esquerda em diferentes ^extensões3. O campo elétrico resultante será traçado como uma elipse, uma função do comprimento de onda. O espectro de CD é, portanto, registrado como elíptica (q), e os dados são apresentados como Elipticidade de Resíduo Médio em função do comprimento de onda.

No caso das proteínas, o Cα de aminoácidos (exceto glicina) é quiral, e este é explorado pela espectroscopia de CD para determinar a estrutura secundária desta macromolécula4. Os espectros de CD de moléculas de proteínas são tipicamente registrados na faixa Far UV. α-helical proteínas têm duas bandas negativas a 222 nm e 208 nm e um pico positivo de 193 ^nm4. Proteínas com estrutura secundária anti-paralela de β folhas mostram um pico negativo de 218 nm e um pico positivo de 195 ^nm4. Proteínas com estruturas desordenadas apresentam baixa elíptica perto de 210 nm e um pico negativo de 195 ^nm4. Assim, o pico/bandas bem definidos para diferentes estruturas secundárias fazem do CD uma ferramenta conveniente para elucidar as alterações conformais ocorridas na estrutura secundária das proteínas durante a desnaturação, bem como a ligação de ligantes.

Os ácidos nucleicos têm três fontes de quiralidade: a molécula de açúcar, a helicidade da estrutura secundária e a ordem terciária de longo alcance do DNA no ^ambiente5,6. Os espectros de CD de ácidos nucleicos são tipicamente registrados na faixa de 190 a 300 ^nm5,6. Cada conformação do DNA, assim como as proteínas, dá um espectro característico, embora os picos/bandas possam variar em alguns graus devido às condições de solvente e diferenças nas sequências de ^DNA7. O B-DNA, a forma mais comum, é caracterizado por um pico positivo em torno de 260-280 nm e um pico negativo em torno de 245 ^nm6. Os picos/bandas de DNA de forma B são geralmente pequenos porque os pares de base são perpendiculares à dupla hélice, conferindo quiralidade fraca à molécula. O DNA A dá um pico positivo dominante de 260 nm e um pico negativo em torno de 210 ^nm6. Z-DNA, a hélice canhota, dá uma faixa negativa a 290 nm e um pico positivo em torno de 260 ^nm6. Este DNA também dá um pico extremamente negativo em 205 ^nm6.

Além dessas conformações, o DNA também pode formar trigêmeos, quadruplos e grampos, todos os quais podem ser distinguidos pela espectroscopia do CD. O G-quadruplex paralelo dá uma faixa positiva dominante a 260 nm, enquanto o G-quadruplex anti-paralelo dá uma banda negativa a 260 nm e um pico positivo de 290 nm, tornando fácil distinguir entre as duas formas de estruturas quádruplas6. Triplexes não dão um espectro ^{característico8}. Por exemplo, os espectros de um DNA de 36 nucleotídeos com potencial para formar uma hélice tripla intramolecular contendo pares de base G.G.C e T.A.T na presença de Na⁺ mostram uma forte faixa negativa a 240 nm e um pico positivo amplo. O amplo pico positivo mostra contribuições em 266, 273 e 286 nm. O mesmo oligonucleotídeo na presença de Na⁺ e Zn⁺ mostra quatro bandas negativas (213, 238, 266 e 282 nm) e um pico positivo de 258 nm. Assim, os espectros do DNA triplex podem variar dependendo das condições do ^sal8.

Além dessas conformações, os espectros de CD permitiram a identificação de outra forma de DNA chamada DNA X. O DNA-X é formado quando a sequência de DNA contém resíduos alternativos de adenina e timina. Os espectros de CD do DNA X contêm dois picos negativos de 250 e 280 nm. Há muito pouca informação disponível sobre O X-DNA, embora tenha sido especulado para funcionar como uma pia para supercoilação ^positiva6,9. Mudanças nos espectros de CD também podem revelar detalhes sobre interações ligantes-proteínas e, portanto, foram adicionadas ao arsenal de métodos moleculares para detectar interações medicamentosa-proteína10,11,12,13,14. Os espectros de CD também têm sido utilizados para monitorar as mudanças na estrutura secundária de proteínas durante o processo de ^dobramento15. Da mesma forma, os espectros de CD também podem ser usados para sondar interações ligantes-DNA16,17.

A espectroscopia de CD, portanto, é um método fácil e barato para distinguir entre as diferentes formas de conformação de DNA, desde que haja acesso a equipamentos e softwares não tão baratos. O método é extremamente sensível e rápido. Requer apenas uma pequena quantidade de DNA, dando-lhe uma vantagem sobre a técnica alternativa de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR). Titulações com ligantes e substratos também são fáceis de executar. A maior restrição é que o DNA deve ser altamente puro. É aconselhável usar eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE)-purificada dna.

As informações obtidas pelos espectros de CD têm sido usadas principalmente para deduzir características estruturais proteicas e identificar conformadores de DNA distintos. Neste estudo, os espectros de CD têm sido utilizados para integrar os resultados obtidos a partir de um experimento in vivo Chromatin Imunoprecipitation (ChIP) para delinear se a proteína de interesse/fator de transcrição predito pode provocar uma mudança conformacional na região promotora de seus genes efeitos. Essa colaboração auxilia no progresso das técnicas espectroscópicas tradicionais do CD, prevendo o mecanismo de regulação da transcrição pelo fator de transcrição previsto sobre e em torno do site de início da transcrição (TSS) de um promotor.

A remodelagem da cromatina é um mecanismo bem definido conhecido para regular os processos metabólicos do DNA, tornando a cromatina bem embalada acessível a vários fatores regulatórios, como fatores de transcrição, componentes da replicação do DNA ou proteínas de reparação de danos. Os remodeladores de cromatina dependentes de ATP, também conhecidos como a família de proteínas SWI/SNF, são proteínas remodeladoras-chave presentes em células eucarióticas18,19. O agrupamento filogenético categorizou a família de proteínas SWI/SNF em 6 ^subgrupos20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like, e distante. O SMARCAL1, proteína de interesse neste estudo, pertence ao subgrudo ^distante20. Esta proteína tem sido usada para investigar seu modo de regulação transcricional usando espectroscopia de CD.

A maioria dos membros das proteínas de remodelação de cromatina dependentes da ATP tem sido mostrada para reposicionar ou despejar nucleossomos ou mediar a troca de variantes histone de forma dependente de ^ATP21,22. No entanto, alguns membros desta família não foram mostrados para remodelar nucleosomos, por exemplo, SMARCAL1. Embora estudos tenham demonstrado que o SMARCAL1 associa-se a cromossomos de politenso, faltam evidências experimentais sobre sua capacidade de remodelar nucleossomos^. Portanto, foi postulado que o SMARCAL1 pode regular a transcrição alterando a conformação do ^DNA24. A espectroscopia de CD forneceu um método fácil e acessível para validar essa hipótese.

SMARCAL1 é uma proteína de remodelação de cromatina dependente de ATP que funciona principalmente como uma helicase de ressaramento25,26,27. Foi postulado para modular a transcrição remodelando a conformação de ^DNA24. Para testar essa hipótese, foi estudado o papel do SMARCAL1 na regulação da transcrição genética durante o dano de DNA induzido pela doxibicina. Nesses estudos, foi utilizado SMARCAL1 para análise in vivo e ADAAD para ensaios de ^vitro28,29. Estudos anteriores mostraram que a ADAAD pode reconhecer o DNA de forma dependente da estrutura, mas independente de ^{sequência30,31}. A proteína se liga idealmente a moléculas de DNA que possuem dois fios em regiões de transição de fios únicos, semelhantes ao DNA de laço-tronco, e hidrolisa ATP ^30,31.

Experimentos in vivo mostraram que o SMARCAL1 regula a expressão de MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER por vinculação às regiões promotoras28,29. A região de interação foi identificada pelos experimentos ^chip28,29. A técnica ChIP é usada para analisar a interação de uma proteína com seu DNA cognato dentro da célula. Seu objetivo é determinar se proteínas específicas, como fatores de transcrição em promotores ou outros locais de ligação de DNA, estão vinculadas a áreas genômicas específicas. A proteína ligada ao DNA é a primeira ligada cruzada usando formaldeído. Isso é seguido pelo isolamento da cromatina. A cromatina isolada é desarquivada a fragmentos de 500 bps, seja por sônica ou digestão nuclease, e a proteína ligada ao DNA é imunoprecipitada usando anticorpos específicos da proteína. A ligação cruzada é invertida, e o DNA é analisado usando a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou a PCR quantitativa em tempo real.

Os resultados do ChIP levaram à hipótese de que o SMARCAL1 possivelmente media a regulação transcricional, induzindo uma mudança conformacional nas regiões promotoras desses genes. O mapeador QGRS e o software Mfold foram utilizados para identificar o potencial dessas regiões promotoras para formar estruturas ^{secundárias28,29}. O mapeador QGRS é usado para prever G-quadruplexes32, enquanto o ^Mfold33 analisa a capacidade de uma sequência de formar estruturas secundárias, como alças-tronco.

Após análise de estrutura secundária, outros experimentos in vitro foram realizados com ATPase A Domain (ADAAD) dependente de DNA ativo recombinante 6X, o homólogo bovino do SMARCAL1, purificado de Escherichia ^coli34. Os ensaios atpase foram realizados utilizando-se a ADAAD para estabelecer que as sequências de DNA identificadas poderiam atuar como ^efeitos28,29. Finalmente, foi realizada a espectroscopia de CD para monitorar as alterações conformais induzidas na molécula de DNA por ^ADAAD28,29.

Para provar que a atividade ATPase da proteína foi essencial para induzir uma alteração conformacional na molécula de DNA, ou o ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA) foi adicionado ao chelate Mg⁺² ou ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), um inibidor específico da proteína SWI/SNF, foi adicionado ^35,36 . Esta técnica espectroscópica do CD pode ser utilizada com qualquer proteína purificada que tenha sido demonstrada pelo ChIP ou qualquer outro ensaio relevante para se ligar a uma região genômica prevista de um promotor.

Protocol

1. Concentração de trabalho dos componentes de reação Prepare as concentrações de trabalho dos buffers para CD e outros componentes de reação recentemente (ver Tabela 1) e mantenha-os a 4 °C antes de configurar as reações.NOTA: Para as reações do CD descritas neste artigo, as concentrações de trabalho dos componentes são as seguintes: Tampão de fosfato de sódio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADi…

Representative Results

ADAAD estabiliza uma estrutura semelhante a um loop-tronco no promotor MYCEvidências experimentais anteriores mostraram que o SMARCAL1 é um regulador negativo do MYC29. A análise da região promotora de 159 bp do gene MYC pelo mapeador QGRS mostrou que a vertente dianteira tinha o potencial de formar um G-quadruplex (Tabela 2). Mfold mostrou que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar u…

Discussion

O objetivo deste artigo é introduzir a técnica de espectroscopia de CD como abordagem para estudar as alterações conformais ocorridas no DNA na presença de proteínas remodeladoras de cromatina dependentes de ATP e vincular essas alterações conformais à expressão genética. A espectroscopia de CD fornece um método rápido e facilmente acessível para estudar as alterações conformais no DNA.

Um ponto crucial a ser considerado para esta técnica é a pureza do DNA e da prote?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500