यह प्रोटोकॉल वायुकोशीय उपकला प्रकार 2 कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस को पुन: प्रस्तुत करके प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, छोटे पैमाने पर इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
बेहतर 3-आयामी (3 डी) फेफड़ों के मॉडल की आवश्यकता है जो देशी फेफड़ों के एल्वियोलस पूर्व विवो की वास्तुशिल्प और सेलुलर जटिलता को दोहराते हैं। हाल ही में विकसित ऑर्गेनोइड मॉडल ने इन विट्रो में फेफड़ों के उपकला पूर्वजों के विस्तार और अध्ययन की सुविधा प्रदान की है, लेकिन ये प्लेटफ़ॉर्म आमतौर पर माउस ट्यूमर-व्युत्पन्न मैट्रिक्स और / या सीरम पर भरोसा करते हैं, और केवल एक या दो सेलुलर वंशों को शामिल करते हैं। यहां, हम विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) के बहु-वंश पुनर्कोशिकीयकरण के आधार पर इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों (ईएलटी) को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। ईएलटी में वायुकोशीय जैसी संरचनाएं होती हैं जिनमें वायुकोशीय उपकला, मेसेनकाइम और एंडोथेलियम शामिल होते हैं, एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सब्सट्रेट के भीतर जो देशी फेफड़ों से मिलते जुलते होते हैं। ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए, चूहे के फेफड़ों को एगरोज़ के साथ फुलाया जाता है, 450 μm-मोटी स्लाइस में कटा हुआ, स्ट्रिप्स में काट दिया जाता है, और विकोशिकीय किया जाता है। परिणामस्वरूप एसेलुलर ईसीएम मचानों को प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स और वायुकोशीय उपकला प्रकार 2 कोशिकाओं (एईसी 2 एस) के साथ फिर से सीड किया जाता है। एईसी 2 एस को सीरम मुक्त, रासायनिक रूप से परिभाषित विकास माध्यम के साथ कम से कम 7 दिनों के लिए ईएलटी संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। ऊतक तैयारी और संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, स्लाइस को एक कैसेट प्रणाली में क्लिप किया जाता है जो समानांतर में कई ईएलटी के हैंडलिंग और मानकीकृत सेल सीडिंग की सुविधा प्रदान करता है। ये ईएलटी एक ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एल्वियोलस के भीतर सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन की जांच के साथ-साथ एईसी 2 और उनके आला को विनियमित करने वाले जैव रासायनिक संकेतों की सुविधा प्रदान करना चाहिए।
एल्वियोली डिस्टल फेफड़े की कार्यात्मक इकाइयाँ हैं, जिसमें वायुकोशीय उपकला प्रकार 1 कोशिकाओं (एईसी 1 एस) और टाइप 2 कोशिकाओं (एईसी 2 एस) द्वारा पंक्तिबद्ध गैस-आदान-प्रदान हवाई क्षेत्रों का एक जालवर्क शामिल है। उपकला अंतर्निहित केशिकाओं का एक घना नेटवर्क है और साथ ही मेसेनकाइम का समर्थन करता है, सभी एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) मचान द्वारा बढ़ाए जाते हैं जो इन नाजुक वायु थैलियों को ताकत और लचीलापन दोनों प्रदान करता है1. एल्वियोली कई फेफड़ों की विकृतियों में चोट की साइट भी है, जिसमें अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस2, तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम3, और गंभीर कोरोनोवायरस रोग -19 (सीओवीआईडी -19) 4 शामिल हैं। यद्यपि पिछले एक दशक में काम ने फेफड़ों के उपकला के भीतर एक उल्लेखनीय प्लास्टिसिटी को उजागर किया है, तंत्र जो कुछ सेटिंग्स में डिस्टल फेफड़ों की मरम्मत को सक्षम करते हैं – और जो दूसरों में मरम्मत को रोकते हैं – गहन जांच का एक क्षेत्र बने हुए हैं5. एल्वियोलस को मॉडल करने के लिए इन विट्रो प्लेटफार्मों में सुधार का विकास वायुकोशीय जीव विज्ञान, उत्थान और चिकित्सीय के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा।
एईसी 2 आत्म-नवीनीकरण और एईसी 1 एस में अंतर करता है, और इस प्रकार डिस्टल फेफड़े 6,7,8 का प्राथमिक स्टेम सेल माना जाता है। हालांकि, ये कोशिकाएं फेनोटाइप9 के नुकसान के बिना प्राथमिक एईसी 2 एस संवर्धन से जुड़ी कठिनाइयों को देखते हुए इन विट्रो अध्ययन के लिए एक विशेष चुनौती पेश करती हैं। पारंपरिक 2-आयामी (2 डी) संस्कृति में, एईसी 2 एस चपटा और एईसी 1 जैसी कोशिकाओं की कुछ विशेषताओं को अपनातेहैं 10. इसके विपरीत, 3 डी संस्कृति रणनीतियों, सबसे अधिक ऑर्गेनोइड, प्राथमिक एईसी 2 एस 6,11,12 में विभेदित सुविधाओं के रखरखाव का समर्थन करते हैं और प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) -व्युत्पन्न एईसी 2 एस13,14 की दीर्घकालिक संस्कृति की अनुमति देते हैं। ऑर्गेनोइड का उपयोग डिस्टल फेफड़ों के विकास15, वायरल संक्रमण11,15 और एईसी 2 से संबंधित आनुवंशिक रोग13,16,17 को मॉडल करने के लिए किया गया है, जो एईसी 2 जीव विज्ञान और उत्थान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि को सक्षम करता है। हालांकि, इन संस्कृति मॉडलों में आमतौर पर केवल एक या दो सेलुलर वंश शामिल होते हैं, और जेल-प्रकार के मैट्रिक्स में कोशिकाओं को एम्बेड करते हैं जो देशी फेफड़ों के एल्वियोलस के वास्तुकला या ईसीएम सब्सट्रेट को पुन: प्राप्त करने में विफल रहते हैं।
ईसीएम आणविक, टोपोलॉजिकल और यांत्रिक संकेतों के माध्यम से सेल फेनोटाइप और व्यवहार का एक महत्वपूर्ण नियामक है; स्टेम सेल भाग्य को विनियमित करने वाले ऊतक-विशिष्ट निचे का एक प्रमुख घटक शामिल है; और एक जलाशय के रूप में कार्य करता है जो स्थानीय रूप से स्रावित विकास कारकों 18,19,20,21 की उपलब्धता को संशोधित करता है। देशी ईसीएम पर संवर्धन कोशिकाएं इस प्रकार विवो ऊतकों के जीव विज्ञान को मॉडल करने के लिए इन विट्रो सिस्टम की भविष्य कहनेवाला क्षमता में वृद्धि कर सकती हैं। विकोशिकीयकरण, एक प्रक्रिया जो डिटर्जेंट, एंजाइम, या भौतिक या अन्य तरीकों के माध्यम से ऊतकों से सेलुलर सामग्री को हटा देती है, बड़े हिस्से में एक देशी अंग के ईसीएम मचान को संरक्षित कर सकती है, जब सावधानीपूर्वक22,23 प्रदर्शन किया जाता है। इस तरह के मचानों को 3 डी बायोमिमेटिक संस्कृति के लिए कोशिकाओं के साथ फिर से आबाद किया जा सकता है। हालांकि, जबकि ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए विकोशिकीय मचानों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, नियमित सेल संस्कृति के लिए उनका उपयोग सीमित किया गया है। पिछले कई अध्ययनों ने फेफड़ों के स्लाइस या छोटे फेफड़ों के ऊतकखंडों के विकोशिकीयकरण और पुनर्कोशिकीयकरण की सूचना दी है। प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन24,25,26 के अलावा, फाइब्रोब्लास्ट-मैट्रिक्स आसंजन 27,28 का अध्ययन करने और फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइप 27,29 पर रोगग्रस्त फेफड़ों के मैट्रिक्स के प्रभाव की जांच करने के लिए पुन: आबाद फेफड़ों के स्लाइस का उपयोग किया गया है। सटीक-कट ऊतक स्लाइस उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध बेहतर प्रौद्योगिकियों के साथ, विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस वायुकोशीय, वायुमार्ग और संवहनी उपसंरचनाओं को संरक्षित करते हुए कोशिकाओं को संस्कृति के लिए एक सुविधाजनक और छोटे पैमाने पर मंच प्रदान कर सकते हैं। कई सेल प्रकारों को शामिल करने से शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी वातावरण के भीतर सेल-सेल इंटरैक्शन के अध्ययन में सक्षम होगा। हालांकि, संस्कृति प्रक्रिया के दौरान ऊतकों की हैंडलिंग की सुविधा के लिए बेहतर रणनीतियों की आवश्यकता होती है, और ज्ञात संख्या में कोशिकाओं के साथ ऊतकों के नियंत्रित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बीजारोपण सुनिश्चित करने के लिए।
यहां, हम प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं, एईसी 2 एस और फाइब्रोब्लास्ट्स के साथ विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) को फिर से तैयार करके इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों (ईएलटी) उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारे पहले वर्णित इंजीनियर हृदय ऊतक प्रणाली30 और पूरे फेफड़ों के विकोशिकीयकरण-पुनर्कोशिकीयकरण रणनीतियों22,31 के अनुकूलन में, हम चूहे के फेफड़ों से पीसीएलएस को काटने और स्लाइस को पुन: प्रयोज्य ऊतक संस्कृति कैसेट में क्लिप करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं जो डाउनस्ट्रीम जोड़तोड़ को सरल और मानकीकृत करते हैं। क्लिप्ड स्लाइस को एसेलुलर ईसीएम मचान बनाने के लिए विकोशिकीय बनाया जाता है, जो अनुकूलित सीडिंग स्नान में फिर से आबाद होते हैं। फेफड़े के टुकड़े मचान महत्वपूर्ण ईसीएम घटकों और वास्तुकला को संरक्षित करते हैं, और कम से कम 7 दिनों के लिए बहु-वंश वायुकोशीय जैसी संरचनाओं के भीतर एईसी 2 के विकास का समर्थन करते हैं। ईएलटी शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी मैट्रिक्स के भीतर एक उपन्यास वायुकोशीय सह-संस्कृति प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसे एईसी 2 एस और एल्वियोलस के बुनियादी जैविक अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हुए फेफड़ों के ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के विकास का समर्थन करना चाहिए।
यह पेपर इन विट्रो में इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए एक मंच के रूप में विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस के उपयोग का वर्णन करता है, जिसमें बहु-वंश वायुकोशीय जैसी संरचनाएं होती हैं। रणनीतियों के संयोजन से जो हमने पहले पूरे फेफड़ों की इंजीनियरिंग22,31 के लिए उच्च-निष्ठा एसेलुलर ईसीएम फेफड़ों के मचानों को फिर से तैयार करने के लिए विकसित किया था, छोटे पैमाने पर इंजीनियर हृदयऊतकों 30 संवर्धन के लिए हमारी मजबूत प्रणाली के साथ, यह प्रोटोकॉल एक टिशू कल्चर सब्सट्रेट के रूप में शारीरिक रूप से प्रासंगिक फेफड़े ईसीएम के उपयोग को सक्षम बनाता है, एक दोहराने योग्य और मध्यम-थ्रूपुट तरीके से।
यहां प्रस्तुत विधियां चूहे के फेफड़ों से ईएलटी मचान तैयारी का विस्तार करती हैं, जो आसानी से प्राप्य हैं, को अगारोज मुद्रास्फीति के लिए बरकरार वायुमार्ग तक सीधी पहुंच के साथ एन ब्लॉक निकाला जा सकता है, और माउस फेफड़ों की तुलना में बड़े आकार के हैं। हालांकि, किसी भी फेफड़े के ऊतक जिसे एगरोज़ के साथ फुलाया जा सकता है और लंबाई में कम से कम 9 मिमी स्लाइस उपज इस प्रणाली के भीतर उपयोग किया जा सकता है। ऊतक स्रोत के बावजूद, एगरोज़ के साथ फेफड़ों के ऊतकों की समान मुद्रास्फीति डाउनस्ट्रीम ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया, कतरन और ऊतक हैंडलिंग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। अंडरफ्लेटेड फेफड़ों के ऊतक सफाई से टुकड़ा नहीं करते हैं, जबकि ओवरफ्लेटेड ऊतक कतरन के दौरान फाड़ सकते हैं। एगरोज़ जेलेशन के बाद, उचित रूप से फुलाए गए ऊतक क्षेत्र फर्म होते हैं लेकिन धीरे-धीरे संदंश के साथ दबाए जाने पर थोड़ा सा देते हैं। बरकरार चूहे के फेफड़ों के लिए, हमने पाया कि निकाले गए फेफड़ों को कई बार हवा के साथ फुलाने से पहले, निष्कर्षण के बाद जितनी जल्दी हो सके एगरोज मुद्रास्फीति के बाद, सर्वोत्तम टुकड़ा करने की क्रिया परिणाम और परिणामस्वरूप ऊतक मचानों की सर्वोत्तम गुणवत्ता होती है। एगरोज़ की उचित मात्रा को अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित करने की आवश्यकता है; चूहे के फेफड़े के लिए फेफड़ों को कुल फेफड़ों की क्षमता तक फुलाने के लिए आवश्यक मात्रा लगभग 30 एमएल / किग्रा पशु द्रव्यमान (उदाहरण के लिए, 350 ग्राम चूहे से फेफड़ों के लिए 10.5 एमएल अगारोज) है। कम सीधी वायुमार्ग पहुंच (जैसे मानव दाताओं से) के साथ बड़े विच्छेदित फेफड़ों के ऊतकों के लिए, ब्रोंकस32 के माध्यम से ऊतक को फुलाने के लिए कुछ अतिरिक्त समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है। बाद के फेफड़ों के टुकड़े टुकड़े के दौरान, सवार पर ऊतक का चयन और अभिविन्यास 1 के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है) सुनिश्चित करें कि स्लाइस ऊतक स्ट्रिप्स उत्पन्न करने के लिए काफी बड़े हैं जिन्हें ऊतक संस्कृति कैसेट में क्लिप किया जा सकता है और 2) पैरेन्काइमल (वायुकोशीय) ऊतक क्षेत्र को अधिकतम करें, बड़े वायुमार्ग या जहाजों को छोड़कर।
टिशू कल्चर कैसेट में पीसीएलएस को क्लिप करना शुरू में एक चुनौतीपूर्ण कदम हो सकता है, लेकिन कैसेट विकोशिकीयकरण और बोने के दौरान ऊतक हैंडलिंग को बहुत सरल बनाते हैं। उत्पन्न होने वाली दो संभावित समस्याएं ऊतक फाड़ (या तो कतरन की प्रक्रिया के दौरान, या विकोशिकीयकरण के दौरान), या क्लिप में ऊतक की स्थिति जिसके परिणामस्वरूप खराब डाउनस्ट्रीम सीडिंग होती है (उदाहरण के लिए, कोई बीजारोपण नहीं, या सिरों पर बोना)। फाड़ एगरोज़ ओवरइन्फ्लेशन, टैब सम्मिलन के दौरान ऊतक के ओवरस्ट्रेचिंग, या टैब डालने के दौरान पर्याप्त ऊतक पकड़ प्रदान करने के लिए बहुत कम ओवरहैंग छोड़ने का परिणाम हो सकता है। ध्यान दें कि स्लाइस जो एक क्लिप अंत में आंसू को सफलतापूर्वक वरीयता दी जा सकती है, हालांकि, उन्हें संस्कृति के दौरान माइक्रोस्कोप के नीचे कल्पना करना मुश्किल है क्योंकि ऊतक सपाट नहीं है। खराब ऊतक बोने (जैसे कि चित्रा 6 सी में) संभवतः दो क्लिप के बीच फ्लैट झूठ नहीं बोलने वाले टुकड़े का परिणाम है, और इस प्रकार उल्टा फ़्लिप होने पर अच्छी तरह से बोने वाले स्नान के आधार के साथ खराब संपर्क बनाता है। एक अन्य संभावित कारण बोने वाले स्नान के तल में कैसेट का अनुचित बैठना अच्छी तरह से है। कतरन के संदर्भ में, दूसरी क्लिप रखते समय ऊतक में थोड़ा अधिक तनाव लागू करें ताकि इसे सपाट झूठ बोलने में मदद मिल सके। कुछ स्लाइस में थोड़ी सी उत्तलता होती है; इन मामलों में उत्तल पक्ष के साथ टुकड़ा क्लिप करें। अभ्यास के साथ, हम आमतौर पर 2% से कम स्लाइस के साथ असफल बीजारोपण का अनुभव करते हैं।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा कुछ विशेष उपकरणों की आवश्यकता है – एक लेजर कटर और एक 3 डी प्रिंटर – ईएलटी तैयारी के लिए प्रारंभिक सामग्री उत्पन्न करने के लिए। हालांकि, एक बार टिशू कल्चर कैसेट और बोने वाले स्नान बनाए जाने के बाद, कोई अतिरिक्त विशेष सामग्री की आवश्यकता नहीं होती है। ईएलटी मचान तैयारी के फेफड़े के टुकड़ा करने की क्रिया और विकोशिकीयकरण चरण मामूली समय लेने वाले हैं; हालाँकि, इन चरणों को अग्रिम रूप से किया जा सकता है, या एक ही समय में कई प्रयोगों की तैयारी के लिए पर्याप्त संख्या में। कई पीसीएलएस (>100 यदि पैरेन्काइमल क्षेत्रों के लिए अनुकूलन करते हैं) को एक ही फेफड़े से काटा जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए स्नैप-जमे हुए किया जा सकता है। जबकि एक एकल फ्रीज-पिघलना चक्र ईसीएम46 को मामूली अल्ट्रास्ट्रक्चरल क्षति का कारण बन सकता है, यहां तक कि कई फ्रीज-पिघलना चक्रों को ईसीएम 23,47 में महत्वपूर्ण नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए प्रदर्शित किया गया है। एक प्रयोग से पहले पीसीएलएस को क्लिप और विकोशिकीय भी किया जा सकता है, जिसका उपयोग एक महीने के भीतर किया जा सकता है। (विशेष रूप से, वर्णित विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल को लगभग 6 घंटों में पूरा किया जा सकता है, जो पहले वर्णित विधियों पर एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है जिसके लिए एक दिन या उससे अधिक27,28 की आवश्यकता होती है। एक बार मचान तैयार हो जाने के बाद, सेल सीडिंग प्रक्रिया सरल और तेज़ होती है, और ईएलटी की संस्कृति को विशेष तकनीकों की आवश्यकता नहीं होती है।
वर्णित ईएलटी विधि की एक चेतावनी क्षेत्र-विशिष्ट बोने की कमी है, अर्थात, विशेष रूप से वायुकोशीय अंतरिक्ष में एईसी 2 एस की डिलीवरी, या विशेष रूप से संवहनी अंतरिक्ष में एंडोथेलियल कोशिकाएं। फिर भी, यद्यपि कोशिकाओं को केवल ऊतक मचानों के शीर्ष पर वरीयता दी जाती है, पुनर्कोशिकीयकरण का पैटर्न गैर-यादृच्छिक है, जिसमें वायुकोशीय जैसे संगठन की कुछ झलक है, जिसमें उपकला के छल्ले भी शामिल हैं। हमें संदेह है कि सेल-सेल इंटरैक्शन, साथ ही ईसीएम संरचना और ज्यामिति20,21 में स्थानीय अंतर, संभवतः मनाया पुनर्कोशिकीयकरण पैटर्न में योगदान करते हैं। इस परिकल्पना के समर्थन में, एक पहले प्रकाशित अध्ययन, जिसमें फाइब्रोब्लास्ट्स को गैर-विशेष रूप से विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस पर वरीयता दी गई थी, ने प्रदर्शित किया कि ऊतक पुन: जनसंख्या और संबंधित सेलुलर फेनोटाइप का पैटर्न सूक्ष्म ऊतक क्षेत्र और ईसीएम मचान स्रोत (जैसे, स्वस्थ बनाम रोगग्रस्त) 27 द्वारा काफी भिन्न होता है। फाइब्रोब्लास्ट्स को इंटरस्टिटियम में आक्रमण करने के लिए भी देखा गया था – वह स्थान जिसमें वे देशी फेफड़ों केऊतकों 1,27 में रहते हैं। प्राथमिक वैकल्पिक विधि जिसे हम वास्तव में क्षेत्र-विशिष्ट तरीके से फेफड़ों के स्लाइस पर संस्कृति कोशिकाओं की कल्पना कर सकते हैं, वायुमार्ग31,48 और संवहनी डिब्बों49,50 के माध्यम से बरकरार विकोशिकीय फेफड़ों को बोना होगा, और फिर पुनर्कोशिकीय ऊतक को टुकड़ा करना होगा। हालांकि, यह विकल्प 1) काफी अधिक लागत-, समय-, और संसाधन-गहन है; 2) कम थ्रूपुट है; 3) जानवरों की बढ़ी हुई संख्या की आवश्यकता होती है; और 4) पूरे फेफड़ों की संस्कृति की चुनौतियों और वरीयता प्राप्त फेफड़ों के बाद के टुकड़ा करने की क्रिया के कारण संदूषण के बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है। देशी सेलुलर संगठन के सभी पहलुओं को दोहराते हुए, ईएलटी प्लेटफॉर्म शारीरिक रूप से प्रासंगिक ईसीएम सब्सट्रेट पर फेफड़ों की कोशिका संस्कृति को सक्षम बनाता है, इस तरह से जो कई और प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है।
ईएलटी प्रणाली का लचीलापन इस मंच का एक बड़ा लाभ है, और किसी भी संख्या में ऊतक मचान, कोशिकाओं या ब्याज की संस्कृति मीडिया के साथ छोटे पैमाने पर फेफड़ों के ऊतक संस्कृति की अनुमति देनी चाहिए। रोगग्रस्त ऊतक या चोट मॉडल से प्राप्त मचानों का उपयोग रोग-परिवर्तित ईसीएम 27,29,51 की स्थापना में सेल-सेल या सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति दे सकता है। हालांकि, ध्यान दें कि विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल को प्रजातियों के बीच मैट्रिक्स मतभेदों के लिए खाते में अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है52. वर्णित सीडिंग रणनीति का उपयोग किसी भी सेल प्रकार के लिए किया जा सकता है, और संस्कृति समयरेखा शोधकर्ता की जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित है। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, पाड़ प्रति 1 x 106 कोशिकाओं को संस्कृति के 7 दिनों के भीतर एक अत्यधिक सेलुलर ऊतक उत्पन्न करना चाहिए, जबकि 1 एक्स 105 कुल कोशिकाओं के परिणामस्वरूप खराब सेलुलरता होती है। समयरेखा के किसी भी अनुकूलन में, ऊतक संस्कृति कैसेट को अंतिम ऊतक बोने के बाद 24 घंटे के बीजारोपण स्नान से हटा दिया जाना चाहिए। यहां, फेफड़ों के वायुकोशीय की कुछ सेलुलर जटिलता को मॉडलिंग करने के लक्ष्य के साथ, हम एक त्रि-संस्कृति पुनर्कोशिकीयकरण रणनीति का वर्णन करते हैं जो कम से कम 7 दिनों के लिए वायुकोशीय जैसी संरचनाओं में अच्छी तरह से विभेदित नवजात एईसी 2 के रखरखाव का समर्थन करता है। हमारे परिणाम ईएलटी के भीतर फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं दोनों के सफल प्रवेश को भी प्रदर्शित करते हैं, संस्कृति सब्सट्रेट की व्यापक प्रयोज्यता और सह-संस्कृति अध्ययन के लिए इसकी उपयुक्तता पर जोर देते हैं। ईएलटी में वयस्क कोशिकाओं को बोने से अधिक शांत वायुकोशीय संरचनाओं के मॉडलिंग की सुविधा मिल सकती है, जबकि मानव पीएससी-व्युत्पन्न एईसी 2 एस को बोना, जिसमें आनुवंशिक संशोधन भी शामिल हैं, मानव रोग13,53 के अनुवादसंबंधी अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। सामान्य तौर पर, ईएलटी प्लेटफ़ॉर्म द्वारा सक्षम बॉटम-अप दृष्टिकोण ब्याज के रीडआउट के लिए विशेष सेल प्रकारों के योगदान की जांच करने का अवसर प्रस्तुत करता है – जैसे कि एईसी 2 प्रसार या भेदभाव राज्य।
संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल एसेलुलर ईसीएम फेफड़ों के टुकड़े मचान के भीतर एईसी 2 एस, फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के सह-संस्कृति अध्ययन के लिए इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत प्रणाली की रूपरेखा तैयार करता है। ईएलटी प्राथमिक एईसी 2 के लिए एक उपन्यास 3 डी संस्कृति रणनीति का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो आज तक आमतौर पर एक अच्छी तरह से विभेदित फेनोटाइप 6,11,12 को बनाए रखने के लिए कम-शारीरिक जेल-प्रकार के मैट्रिक्स पर भरोसा करते हैं। वर्तमान मंच विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस 24,25,26,27,28,29 के पुनर्जनसंख्या में पिछले काम पर बनाता है, लेकिन कई फायदे प्रदान करता है: 1) विकोशिकीयकरण, बीजारोपण और संस्कृति के दौरान ईएलटी हैंडलिंग की सुविधा के लिए एक ऊतक संस्कृति कैसेट प्रणाली; 2) प्रत्येक टुकड़ा मचान पर कोशिकाओं की एक ज्ञात संख्या को ठीक से बीज करने के लिए एक अनुकूलित बीजारोपण स्नान; और 3) एक त्रि-संस्कृति रीसीडिंग रणनीति जो उपकला, मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ वायुकोशीय ऊतक पुन: जनसंख्या को सक्षम बनाती है। इस प्रकार, ईएलटी इन विट्रो मॉडल में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं जो देशी एल्वियोलस और एईसी 2 स्टेम सेल आला की सेलुलर और सब्सट्रेट जटिलता को पकड़ते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले टिशू कल्चर कैसेट डिजाइन को विकसित करने के लिए लोरेंजो सेवानन और जॉर्ज नुनेज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं, उनके वाइब्रेटोम के उपयोग के लिए कामिंस्की प्रयोगशाला, फेफड़ों के टुकड़े करने की क्रिया के साथ सहायता के लिए मौरिज़ियो चियोसिओली और जेसिका नौस, प्रारंभिक पायलट प्रयोगों के साथ सहायता के लिए एली लारोक्को, और प्रोटोकॉल के सावधानीपूर्वक पढ़ने के लिए हांग कियान। इस काम को एनआईएच अनुदान एफ 30 एचएल 143880 (केएलएल), चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम प्रशिक्षण अनुदान टी 32 जीएम 136651 (केएलएल), और यू01 एचएल 145567 (एलईएन) द्वारा समर्थित किया गया था; और हुमासाइट इंक (एलईएन) से एक अप्रतिबंधित अनुसंधान उपहार द्वारा।
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |