Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie
Summary
Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.
Abstract
De ontwikkeling en homeostase van meercellige organismen zijn afhankelijk van gecoördineerde regulatie van celmigratie. Celmigratie is een essentiële gebeurtenis in de constructie en regeneratie van weefsels en is van cruciaal belang voor de embryonale ontwikkeling, immunologische reacties en wondgenezing. Ontregeling van de celmotiliteit draagt bij aan pathologische aandoeningen, zoals chronische ontstekingen en kankermetastase. Celmigratie, weefselinvasie, axon- en dendrietuitgroei beginnen allemaal met actinepolymerisatie-gemedieerde celranduitsteeksels. Hier beschrijven we een eenvoudige, efficiënte, tijdbesparende methode voor de beeldvorming en kwantitatieve analyse van celranduitsteekseldynamiek tijdens het verspreiden. Deze methode meet discrete kenmerken van celrandmembraandynamica, zoals uitsteeksels, retracties en ruches, en kan worden gebruikt om te beoordelen hoe manipulaties van belangrijke actineregulatoren celranduitsteeksels in verschillende contexten beïnvloeden.
Introduction
Celmigratie is een kritisch proces dat de ontwikkeling en functie van alle levende organismen regelt. Celmigratie vindt plaats in zowel fysiologische omstandigheden, zoals embryogenese, wondgenezing en immuunrespons, als bij pathologische aandoeningen, zoals kankermetastase en auto-immuunziekte. Ondanks verschillen in celtypen die deelnemen aan verschillende migratiegebeurtenissen, delen alle celmotiliteitsgebeurtenissen vergelijkbare moleculaire mechanismen, die bewaard zijn gebleven in de evolutie van protozoa tot zoogdieren, en omvatten ze gemeenschappelijke cytoskeletale controlemechanismen die de omgeving kunnen detecteren, reageren op signalen en celgedrag in reactie kunnen moduleren1.
Een eerste fase in celmigratie kan de vorming van zeer dynamische uitsteeksels aan de voorrand van de cel zijn. Achter het lamellipodium bevindt zich de lamellen, die actine koppelt aan myosine II-gemedieerde contractiliteit en adhesie aan het onderliggende substraat bemiddelt. Lamellipodia worden geïnduceerd door extracellulaire stimuli zoals groeifactoren, cytokines en celadhesiereceptoren en worden aangedreven door actinepolymerisatie, die de fysieke kracht levert die het plasmamembraan naar voren duwt2,3. Veel signalerende en structurele eiwitten zijn hierbij betrokken; onder hen zijn Rho GTPases, die coördinerend werken met andere signalen om actine-regulerende eiwitten te activeren, zoals het Arp 2/3-complex, WASP-familie-eiwitten en leden van de Formin- en Spire-families in lamellipodia2,4,5.
Naast actinepolymerisatie is myosine II-activiteit vereist voor het genereren van contractiele krachten op het lamellipodium en de voorste lamellen. Deze samentrekkingen, ook gedefinieerd als celrandterugtrekkingen, kunnen ook het gevolg zijn van depolymerisatie van dendritische actine aan de celrand en zijn van cruciaal belang voor het ontwikkelen van de lamellipodiale voorrand en het uitsteeksel in staat stellen de flexibiliteit van de extracellulaire matrix en andere cellen te voelen en de migratierichting te bepalen6,7,8 . Uitsteeksels van de celrand die zich niet aan het substraat kunnen hechten, vormen perifere membraanruches, plaatachtige structuren die op het ventrale oppervlak van lamellipodia en lamellen verschijnen en achteruit bewegen ten opzichte van de migratierichting. Omdat het lamellipodium zich niet aan het substraat hecht, vormt zich eronder een achterste lamellipodium en duwt het eerste lamellipodium mechanisch naar het bovenste ventrale oppervlak. De actinefilamenten in de ruche die vroeger evenwijdig aan het substraat waren, komen er nu loodrecht op te staan en de ruche bevindt zich nu boven het oprukkende lamellipodium. De ruche die naar achteren beweegt, valt terug in het cytosol en vertegenwoordigt een cellulair mechanisme voor het recyclen van lamellipodiaal actine9,10.
Hier beschrijven we een test voor het meten van celrand uitsteekseldynamiek. De uitsteekseltest maakt gebruik van time-lapse videomicroscopie om gedurende 10 minuten tijdens de verspreidingsfase van de cel een enkele celrand uitsteekseldynamiek te meten. Uitsteekseldynamiek wordt geanalyseerd door kymografen uit deze films te genereren. In principe geeft een kymograaf gedetailleerde kwantitatieve gegevens van bewegende deeltjes in een spatiotemporale plot om een kwalitatief begrip van de celranddynamica te verkrijgen. De intensiteit van het bewegende deeltje wordt uitgezet voor alle beeldstapels in een tijd versus ruimte plot, waarbij de X-as en de Y-as respectievelijk tijd en afstand vertegenwoordigen11. Deze methode maakt gebruik van een handmatige kymograafanalyse met ImageJ om gedetailleerde kwantitatieve gegevens te verkrijgen, waardoor informatie uit films en afbeeldingen kan worden opgehaald in geval van een lage signaal-ruisverhouding en / of hoge functiedichtheid, en de analyse van afbeeldingen die zijn verkregen in fasecontrastlichtmicroscopie of slechte beeldkwaliteit.
De celrand uitsteekseldynamiektest die hierin wordt beschreven, is een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve methode. Als zodanig, en omdat is aangetoond dat het direct correleert met celmigratie11,12, kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het testen van cytoskeletale dynamica die betrokken is bij celmotiliteit voordat wordt besloten om meer middelen-veeleisende methoden uit te voeren. Bovendien maakt het ook kwantitatieve meting mogelijk van hoe genetische manipulaties (knock-out, knockdown of reddingsconstructies) van cytoskeletale eiwitten de cytoskeletale dynamiek beïnvloeden met behulp van een eenvoudig platform. De assay is een leerzaam model voor het onderzoeken van cytoskeletale dynamica in de context van celmigratie en kan worden gebruikt voor opheldering van de mechanismen en moleculen die ten grondslag liggen aan celmotiliteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cel-edge uitsteekseldynamiek, bestaande uit uitsteeksels, retracties en ruches, is zowel een vereiste als een potentiële snelheidsbeperkende gebeurtenis in celmotiliteit. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het meten van de dynamiek van celranduitsteeksels tijdens het verspreiden. Deze methode maakt beeldvorming met een korte tijd mogelijk, genereert een aanzienlijke hoeveelheid gegevens, vereist geen fluorescerende etikettering van cellen of dure fluorescerende microscopieapparatuur en kan worden …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH MH115939, NS112121, NS105640 en R56MH122449-01A1 (aan Anthony J. Koleske) en van de Israel Science Foundation (subsidies nummer 1462/17 en 2142/21) (aan Hava Gil-Henn).
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
Referências
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. . The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers–assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Bioquímica. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
