लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशन डायनेमिक्स को मापना
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कोशिकाओं को फैलाने के किनारे पर प्रोट्रूशन के गतिशील मापदंडों (प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन, रफल्स) को मापना है।
Abstract
बहुकोशिकीय जीवों का विकास और होमोस्टैसिस कोशिका प्रवास के समन्वित विनियमन पर निर्भर करता है। कोशिका प्रवास ऊतकों के निर्माण और उत्थान में एक आवश्यक घटना है, और भ्रूण विकास, प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं और घाव भरने में महत्वपूर्ण है। कोशिका गतिशीलता की विकृति रोग संबंधी विकारों में योगदान देती है, जैसे कि पुरानी सूजन और कैंसर मेटास्टेसिस। सेल माइग्रेशन, ऊतक आक्रमण, अक्षतंतु, और डेंड्राइट आउटग्रोथ सभी एक्टिन पोलीमराइजेशन-मध्यस्थता सेल-एज प्रोट्रूशन के साथ शुरू करते हैं। यहां, हम प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता के इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सरल, कुशल, समय-बचत विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि सेल-एज झिल्ली गतिशीलता की असतत विशेषताओं को मापती है, जैसे कि प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन और रफल्स, और रफल्स, और इसका उपयोग यह आकलन करने के लिए किया जा सकता है कि प्रमुख एक्टिन नियामकों के जोड़तोड़ विभिन्न संदर्भों में सेल-एज प्रोट्रूशन को कैसे प्रभावित करते हैं।
Introduction
सेल माइग्रेशन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो सभी जीवित जीवों के विकास और कार्य को नियंत्रित करती है। सेल माइग्रेशन दोनों शारीरिक स्थितियों में होता है, जैसे कि भ्रूणजनन, घाव भरने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और रोग संबंधी स्थितियों में, जैसे कि कैंसर मेटास्टेसिस और ऑटोइम्यून रोग। विभिन्न प्रवासी घटनाओं में भाग लेने वाले सेल प्रकारों में अंतर के बावजूद, सभी सेल गतिशीलता घटनाएं समान आणविक तंत्र साझा करती हैं, जिन्हें प्रोटोजोआ से स्तनधारियों तक विकास में संरक्षित किया गया है, और इसमें आम साइटोस्केलेटल नियंत्रण तंत्र शामिल हैं जो पर्यावरण को समझ सकते हैं, संकेतों का जवाब दे सकते हैं, और प्रतिक्रिया में सेल व्यवहार को संशोधित कर सकते हैं1।
सेल माइग्रेशन में एक प्रारंभिक चरण सेल के अग्रणी किनारे पर अत्यधिक गतिशील प्रोट्रूशन का गठन हो सकता है। लैमेलिपोडियम के पीछे एक लामेला पा सकता है, जो मायोसिन द्वितीय-मध्यस्थता संकुचन के लिए एक्टिन जोड़ता है और अंतर्निहित सब्सट्रेट के लिए आसंजन की मध्यस्थता करता है। लैमेलिपोडिया विकास कारकों, साइटोकिन्स और सेल आसंजन रिसेप्टर्स जैसे बाहरी उत्तेजनाओं से प्रेरित होते हैं और एक्टिन पोलीमराइजेशन द्वारा संचालित होते हैं, जो भौतिक बल प्रदान करता है जो प्लाज्मा झिल्ली को आगे बढ़ाता है2,3। कई सिग्नलिंग और संरचनात्मक प्रोटीन इसमें शामिल किए गए हैं; उनमें से Rho GTPases हैं, जो अन्य संकेतों के साथ समन्वय से कार्य करते हैं ताकि एक्टिन-विनियमित प्रोटीन को सक्रिय किया जा सके जैसे कि Arp 2/3 कॉम्प्लेक्स, WASP परिवार के प्रोटीन, और लैमेलिपोडिया 2,4,5 में फॉर्मिन और स्पीयर परिवारों के सदस्य।
एक्टिन पोलीमराइजेशन के अलावा, मायोसिन II गतिविधि लैमेलिपोडियम और पूर्वकाल लामेला में संकुचनशील बलों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। ये संकुचन, जिसे सेल-एज रिट्रेक्शन के रूप में भी परिभाषित किया गया है, सेल परिधि पर डेंड्राइटिक एक्टिन के डीपोलीमराइजेशन के परिणामस्वरूप भी हो सकता है और लैमेलिपोडियल अग्रणी किनारे को विकसित करने और प्रोट्रूशन को बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स और अन्य कोशिकाओं के लचीलेपन को समझने और माइग्रेशन की दिशा निर्धारित करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। . सेल एज प्रोट्रूशन जो सब्सट्रेट से संलग्न नहीं हो सकते हैं, परिधीय झिल्ली रफल्स, शीट जैसी संरचनाएं बनाएंगे जो लैमेलिपोडिया और लामेला की वेंट्रल सतह पर दिखाई देते हैं और माइग्रेशन की दिशा के सापेक्ष पीछे की ओर बढ़ते हैं। जैसा कि लैमेलिपोडियम सब्सट्रेट से जुड़ने में विफल रहता है, एक पीछे का लैमेलिपोडियम इसके नीचे बनता है और यांत्रिक रूप से पहले लैमेलिपोडियम को ऊपरी वेंट्रल सतह की ओर धकेलता है। रफल में एक्टिन फिलामेंट्स जो पहले सब्सट्रेट के समानांतर थे, अब इसके लंबवत हो जाते हैं, और रफल अब आगे बढ़ने वाले लैमेलिपोडियम के ऊपर स्थित है। रफ़ल जो पीछे की ओर चलता है, साइटोसोल में वापस आ जाता है और लैमेलिपोडियल एक्टिन 9,10 रीसाइक्लिंग के लिए एक सेलुलर तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है।
यहां, हम सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता के माप के लिए एक परख का वर्णन करते हैं। फलाव परख सेल के प्रसार चरण के दौरान 10 मिनट के लिए एकल सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता को मापने के लिए समय-चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है। इन फिल्मों से kymographs उत्पन्न करके फलाव गतिशीलता का विश्लेषण किया जाता है। सिद्धांत रूप में, एक kymograph सेल किनारे गतिशीलता की एक गुणात्मक समझ उपज करने के लिए एक spatiotemporal साजिश में चलती कणों का विस्तृत मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है। चलती कण की तीव्रता को एक समय बनाम अंतरिक्ष प्लॉट में सभी छवि स्टैक के लिए प्लॉट किया जाता है, जहां एक्स-अक्ष और वाई-अक्ष क्रमशः समय और दूरी का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह विधि विस्तृत मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए ImageJ के साथ एक मैनुअल काइमोग्राफ विश्लेषण का उपयोग करती है, जिससे कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और / या उच्च सुविधा घनत्व के मामले में फिल्मों और छवियों से जानकारी प्राप्त करने में सक्षम होता है, और चरण-विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोपी या खराब छवि गुणवत्ता में प्राप्त छवियों का विश्लेषण होता है।
सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता परख यहाँ वर्णित एक तेज, सरल, और लागत प्रभावी विधि है। जैसे, और क्योंकि इसे सीधे सेल माइग्रेशन 11,12 के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है, इसका उपयोग अधिक संसाधन-मांग वाले तरीकों को करने का निर्णय लेने से पहले सेल गतिशीलता में शामिल साइटोस्केलेटल गतिशीलता के परीक्षण के लिए एक प्रारंभिक विधि के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, यह साइटोस्केलेटल प्रोटीन के आनुवंशिक जोड़तोड़ (नॉकआउट, नॉकडाउन, या बचाव निर्माण) के मात्रात्मक माप को भी सक्षम बनाता है, जो एक सरल मंच का उपयोग करके साइटोस्केलेटल गतिशीलता को प्रभावित करता है। परख सेल माइग्रेशन के संदर्भ में साइटोस्केलेटल गतिशीलता की खोज के लिए एक शिक्षाप्रद मॉडल है और इसका उपयोग कोशिका गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र और अणुओं के स्पष्टीकरण के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल-एज प्रोट्रूशन गतिशीलता, जिसमें प्रोट्रूशन, रिट्रेक्शन और रफल्स शामिल हैं, सेल गतिशीलता में एक शर्त और संभावित दर-सीमित घटना दोनों है। यहां हम प्रसार के दौरान सेल-एज प्रोट्रूशियंस की गतिशीलता को मा…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अनुदान NIH MH115939, NS112121, NS105640, और R56MH122449-01A1 (एंथोनी जे कोलेस्के के लिए) और इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 1462/17 और 2142/21) (Hava Gil-Henn के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
Referências
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. . The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers–assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Bioquímica. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
