Måling av cellekantprotruderingsdynamikk under spredning ved hjelp av live-cellemikroskopi

Summary

Denne protokollen tar sikte på å måle de dynamiske parametrene (fremspring, tilbaketrekninger, ruffles) av fremspring på kanten av spredningsceller.

Abstract

Utviklingen og homeostase av multicellulære organismer er avhengig av koordinert regulering av cellemigrasjon. Cellemigrasjon er en viktig begivenhet i bygging og regenerering av vev, og er kritisk i embryonal utvikling, immunologiske responser og sårheling. Dysregulering av cellemotilitet bidrar til patologiske lidelser, som kronisk betennelse og kreftmetastase. Cellemigrasjon, vevsinvasjon, axon og dendritutvekst starter alle med aktinpolymeriseringsmediert cellekantutstikk. Her beskriver vi en enkel, effektiv, tidsbesparende metode for avbildning og kvantitativ analyse av cellekant fremspringdynamikk under spredning. Denne metoden måler diskrete egenskaper ved cellekantmembrandynamikk, for eksempel fremspring, tilbaketrekninger og ruffles, og kan brukes til å vurdere hvordan manipulasjoner av viktige aktinregulatorer påvirker cellekantutstikk i forskjellige sammenhenger.

Introduction

Cellemigrasjon er en kritisk prosess som styrer utviklingen og funksjonen til alle levende organismer. Cellemigrasjon skjer i både fysiologiske forhold, som embryogenese, sårheling og immunrespons, og i patologiske forhold, som kreftmetastase og autoimmun sykdom. Til tross for forskjeller i celletyper som deltar i forskjellige trekkhendelser, deler alle cellemotilitetshendelser lignende molekylære mekanismer, som har blitt bevart i evolusjon fra protozoer til pattedyr, og involverer vanlige cytoskeletale kontrollmekanismer som kan føle miljøet, reagere på signaler og modulere celleadferd som ^svar1.

Et innledende stadium i cellemigrasjon kan være dannelsen av svært dynamiske fremspring i forkant av cellen. Bak lamellipodiumet kan man finne lamellen, som par handler med myosin II-mediert kontraktilitet og formidler vedheft til det underliggende substratet. Lamellipodia er indusert av ekstracellulære stimuli som vekstfaktorer, cytokiner og celleadhesjonsreseptorer og drives av aktinpolymerisering, noe som gir den fysiske kraften som skyver plasmamembranen ^fremover2,3. Mange signalering og strukturelle proteiner har blitt involvert i dette; blant dem er Rho GTPases, som virker koordinert med andre signaler for å aktivere aktinregulerende proteiner som Arp 2/3-komplekset, WASP-familieproteiner og medlemmer av Formin- og Spire-familiene i lamellipodia2,4,5.

I tillegg til aktinpolymerisering er myosin II-aktivitet nødvendig for å generere kontraktilkrefter ved lamellipodium og den fremre lamellen. Disse sammentrekningene, også definert som tilbaketrekninger av cellekanten, kan også skyldes depolymerisering av dendritisk aktin ved celleperiærien og er avgjørende for å utvikle lamellipodial forkant og la fremspringet føle fleksibiliteten til den ekstracellulære matrisen og andre celler og bestemme retningen for ^{migrasjon6,7,8} . Cellekantutstikk som ikke kan festes til substratet, vil danne perifere membran ruffles, arklignende strukturer som vises på ventral overflate av lamellipodia og lamell og beveger seg bakover i forhold til migrasjonsretningen. Ettersom lamellipodiumet ikke klarer å feste seg til substratet, dannes et bakre lamellipodium under det og skyver mekanisk det første lamellipodiumet mot den øvre ventrale overflaten. Aktinfilamentene i ruffle som tidligere var parallelle med substratet, blir nå vinkelrett på det, og ruffle er nå plassert over det fremadstormende lamellipodiumet. Ruffle som beveger seg bakover faller tilbake i cytosol og representerer en cellulær mekanisme for resirkulering lamellipodial ^actin9,10.

Her beskriver vi en analyse for måling av cellekant fremspringdynamikk. Fremspringsanalysen bruker videomikroskopi for tidsforløp til å måle enkeltcellekantutstikksdynamikk i 10 minutter under spredningsfasen av cellen. Fremspringsdynamikk analyseres ved å generere kymografer fra disse filmene. I prinsippet gir en kymografi detaljerte kvantitative data om bevegelige partikler i et romlig plott for å gi en kvalitativ forståelse av cellekantdynamikk. Intensiteten til den bevegelige partikkelen tegnes inn for alle bildestakker i en tid kontra et mellomrom, der X-aksen og Y-aksen representerer henholdsvis tid og ^avstand11. Denne metoden bruker en manuell kymografanalyse med ImageJ for å få detaljerte kvantitative data, slik at du kan hente informasjon fra filmer og bilder i tilfelle lavt signal-til-støy-forhold og / eller høy funksjonstetthet, og analysen av bilder som er anskaffet i fasekontrastlysmikroskopi eller dårlig bildekvalitet.

Cellekantprotrusjonsdynamikkanalysen som er beskrevet her, er en rask, enkel og kostnadseffektiv metode. Som sådan, og fordi det har vist seg å direkte korrelere med ^{cellemigrasjon11,12}, kan den brukes som en foreløpig metode for å teste cytoskeletal dynamikk involvert i cellemotilitet før du bestemmer deg for å utføre mer ressurskrevende metoder. Videre muliggjør den også kvantitativ måling av hvordan genetiske manipulasjoner (knockout, knockdown eller redningskonstruksjoner) av cytoskeletale proteiner påvirker cytoskeletal dynamikk ved hjelp av en enkel plattform. Analysen er en lærerik modell for å utforske cytoskeletal dynamikk i sammenheng med cellemigrasjon og kan brukes til belysning av mekanismene og molekylene som ligger til grunn for cellemotiliteten.

Protocol

Alle metoder beskrevet i denne protokollen er godkjent av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC) ved Bar-Ilan University. MERK: En trinnvis grafisk fremstilling av prosedyren som er beskrevet i dette avsnittet, vises i figur 1. 1. Cellekultur MERK: Cellene som brukes i protokollen er mus embryonale fibroblaster (MEFer) som ble generert fra E11.5-13.5 embryoer av villtype C57BL …

Representative Results

I eksperimentet beskrevet i figur 2 ble udødeliggjorte MEFer belagt på glassbunnsretter forhåndsbelagt med fibronectin for å aktivere integrinsk mediert signalering, blokkert av denaturert BSA, for å blokkere frie potensielle steder for celleadhesjon som ikke er avhengig av integrinsk aktivering. For å nå den logaritmiske vekstfasen ved 70% -80% sammenløp av celler på eksperimentets dag, ble 0,7 x 106 MEF-er belagt i en vevskulturplate med 10 cm diameter 16 timer før eks…

Discussion

Cell-edge fremspringdynamikk, bestående av fremspring, tilbaketrekninger og ruffles, er både en forutsetning og en potensiell hastighetsbegrensende hendelse i cellemotilitet. Her beskriver vi en rask og enkel metode for å måle dynamikken i cellekantprotrusjoner under spredning. Denne metoden muliggjør korttidsavbildning, genererer en betydelig mengde data, krever ikke fluorescerende merking av celler eller dyrt fluorescerende mikroskopiutstyr, og kan brukes som en foreløpig metode for å teste cytoskeletal dynamikk…

Materials

10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A