Измерение динамики протрузии клеточного края во время распространения с помощью микроскопии живых клеток

Summary

Этот протокол направлен на измерение динамических параметров (выступы, втягивания, оборки) выступов на краю распространяющихся клеток.

Abstract

Развитие и гомеостаз многоклеточных организмов зависят от скоординированной регуляции миграции клеток. Миграция клеток является важным событием в построении и регенерации тканей и имеет решающее значение для эмбрионального развития, иммунологических реакций и заживления ран. Нарушение регуляции подвижности клеток способствует патологическим нарушениям, таким как хроническое воспаление и метастазирование рака. Миграция клеток, тканевая инвазия, аксон и дендррит — все это инициируется опосредованными актиновой полимеризацией протрузий клеточных краев. Здесь мы описываем простой, эффективный, экономящий время метод визуализации и количественного анализа динамики протрузии края клетки во время распространения. Этот метод измеряет дискретные особенности динамики клеточной мембраны, такие как протрузии, втягивания и оборки, и может быть использован для оценки того, как манипуляции с ключевыми регуляторами актина влияют на протрузии края клетки в различных контекстах.

Introduction

Миграция клеток является критическим процессом, который контролирует развитие и функционирование всех живых организмов. Миграция клеток происходит как в физиологических состояниях, таких как эмбриогенез, заживление ран и иммунный ответ, так и в патологических состояниях, таких как метастазирование рака и аутоиммунные заболевания. Несмотря на различия в типах клеток, которые принимают участие в различных миграционных событиях, все события подвижности клеток имеют сходные молекулярные механизмы, которые были сохранены в эволюции от простейших до млекопитающих и включают общие механизмы контроля цитоскелета, которые могут ощущать окружающую среду, реагировать на сигналы и модулировать поведение клеток в ^ответ1.

Начальной стадией миграции клеток может быть образование высокодинамичных выступов на переднем крае клетки. За ламелиподиумом можно найти пластинку, которая соединяет актин с миозином II-опосредованной сократимостью и опосредует адгезию к нижележащему субстрату. Ламеллиподии индуцируются внеклеточными стимулами, такими как факторы роста, цитокины и рецепторы клеточной адгезии, и управляются полимеризацией актина, которая обеспечивает физическую силу, которая толкает плазматическую мембрану ^{вперед2,3}. Многие сигнальные и структурные белки были вовлечены в это; среди них Rho GTPases, которые действуют согласованно с другими сигналами для активации актин-регулирующих белков, таких как комплекс Arp 2/3, белки семейства WASP и члены семейств Formin и Spire в lamellipodia2,4,5.

В дополнение к полимеризации актина, активность миозина II необходима для генерации сократительных сил в ламелиподиуме и передней пластинке. Эти сокращения, также определяемые как втягивания края клетки, также могут быть результатом деполимеризации дендритного актина на периферии клетки и имеют решающее значение для развития ламелиподиального переднего края и позволяют выступу ощущать гибкость внеклеточного матрикса и других клеток и определять направление миграции6,7,8 . Протрузии края клеток, которые не могут прикрепиться к субстрату, образуют периферические мембранные оборки, листообразные структуры, которые появляются на вентральной поверхности ламеллиподий и ламелей и движутся назад относительно направления миграции. Поскольку ламеллиподиум не прикрепляется к субстрату, под ним образуется задний ламеллиподиум, который механически толкает первый ламеллиподий к верхней вентральной поверхности. Актиновые нити в оборке, которые раньше были параллельны субстрату, теперь становятся перпендикулярными ей, и оборка теперь расположена над наступающим ламелиподием. Оборка, которая движется назад, падает обратно в цитозоль и представляет собой клеточный механизм рециркуляции ламеллиподиального ^{актина9,10}.

Здесь мы опишем анализ для измерения динамики протрузии края клетки. Протрузионный анализ использует покадровую видеомикроскопию для измерения динамики протрузии с одним краем клетки в течение 10 минут во время фазы распространения клетки. Динамика протрузии анализируется путем генерации кимографов из этих фильмов. В принципе, кимограф передает подробные количественные данные движущихся частиц на пространственно-временном участке, чтобы дать качественное понимание динамики кромок клеток. Интенсивность движущейся частицы отображается для всех стеков изображений на графике времени и пространства, где ось X и ось Y представляют время и расстояние ^{соответственно11}. Этот метод использует ручной анализ кимографа с ImageJ для получения подробных количественных данных, что позволяет извлекать информацию из фильмов и изображений в случае низкого отношения сигнал-шум и / или высокой плотности признаков, а также анализ изображений, полученных в фазово-контрастной световой микроскопии или плохого качества изображения.

Описанный в настоящем описании анализ динамики протрузии клеточного края является быстрым, простым и экономически эффективным методом. Таким образом, и поскольку было показано, что он напрямую коррелирует с миграцией ^{клеток11,12}, он может быть использован в качестве предварительного метода для тестирования динамики цитоскелета, участвующего в подвижности клеток, прежде чем принять решение о выполнении более ресурсоемких методов. Кроме того, он также позволяет количественно измерить, как генетические манипуляции (нокаут, нокдаун или спасательные конструкции) цитоскелетных белков влияют на динамику цитоскелета с использованием простой платформы. Анализ является поучительной моделью для изучения динамики цитоскелета в контексте миграции клеток и может быть использован для выяснения механизмов и молекул, лежащих в основе подвижности клеток.

Protocol

Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены институциональным Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Бар-Илан. ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговое графическое изображение процедуры, описанной в этом разделе, показано на рисунке 1</strong…

Representative Results

В эксперименте, описанном на рисунке 2, увековеченные MEF наносили на посуду со стеклянным дном, предварительно покрытую фибронектином, для активации опосредованной интегрином сигнализации, блокируемой денатурированным BSA, чтобы блокировать свободные потенциальные уча…

Discussion

Динамика протрузии края клетки, состоящая из протрузий, втягиваний и оборок, является как предпосылкой, так и потенциальным событием, ограничивающим скорость в подвижности клеток. Здесь описан быстрый и простой метод измерения динамики протрузий кромок ячеек при распространении. Этот…

Materials

10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A