Mätning av cellkantsutsprångsdynamik under spridning med hjälp av livecellmikroskopi

Summary

Detta protokoll syftar till att mäta de dynamiska parametrarna (utsprång, indragningar, volanger) av utsprång vid kanten av spridande celler.

Abstract

Utvecklingen och homeostasen av multicellulära organismer är beroende av samordnad reglering av cellmigration. Cellmigration är en viktig händelse vid konstruktion och regenerering av vävnader och är avgörande för embryonal utveckling, immunologiska svar och sårläkning. Dysregulering av cellmotilitet bidrar till patologiska störningar, såsom kronisk inflammation och cancermetastasering. Cellmigration, vävnadsinvasion, axon och dendritutväxt initieras alla med aktinpolymerisationsmedierade cellkantsutsprång. Här beskriver vi en enkel, effektiv och tidsbesparande metod för avbildning och kvantitativ analys av cellkantsutsprångsdynamik under spridning. Denna metod mäter diskreta egenskaper hos cellkantsmembrandynamiken, såsom utsprång, indragningar och volanger, och kan användas för att bedöma hur manipuleringar av viktiga aktinregulatorer påverkar cellkantsutsprång i olika sammanhang.

Introduction

Cellmigration är en kritisk process som styr utvecklingen och funktionen hos alla levande organismer. Cellmigration sker i både fysiologiska tillstånd, såsom embryogenes, sårläkning och immunsvar, och i patologiska tillstånd, såsom cancermetastaser och autoimmun sjukdom. Trots skillnader i celltyper som deltar i olika migrationshändelser delar alla cellmotilitetshändelser liknande molekylära mekanismer, som har bevarats i evolutionen från protozoer till däggdjur, och involverar gemensamma cytoskelettkontrollmekanismer som kan känna av miljön, svara på signaler och modulera cellbeteende som ^svar1.

Ett första steg i cellmigration kan vara bildandet av mycket dynamiska utsprång vid cellens framkant. Bakom lamellipodiet kan man hitta lamellen, som kopplar aktin till myosin II-medierade kontraktilitet och förmedlar vidhäftning till det underliggande substratet. Lamellipodi induceras av extracellulära stimuli såsom tillväxtfaktorer, cytokiner och celladhesionsreceptorer och drivs av aktinpolymerisation, vilket ger den fysiska kraften som skjuter plasmamembranet ^framåt2,3. Många signalerings- och strukturproteiner har varit inblandade i detta; bland dem är Rho GTPaser, som verkar samordnat med andra signaler för att aktivera aktinreglerande proteiner såsom Arp 2/3-komplexet, WASP-familjeproteiner och medlemmar av Formin- och Spire-familjerna i lamellipodia2,4,5.

Förutom aktinpolymerisation krävs myosin II-aktivitet för att generera kontraktila krafter vid lamellipodiet och den främre lamellen. Dessa sammandragningar, även definierade som cellkantsindragningar, kan också bero på depolymerisation av dendritiskt aktin vid cellperiferin och är kritiska för att utveckla den lamellipodiella framkanten och låta utsprånget känna av flexibiliteten hos den extracellulära matrisen och andra celler och bestämma migrationsriktningen6,7,8 . Cellkantsutsprång som inte kan fästa vid substratet kommer att bilda perifera membranvolanger, arkliknande strukturer som uppträder på den ventrala ytan av lamellipodi och lamell och rör sig bakåt i förhållande till migrationsriktningen. Eftersom lamellipodiet inte fäster vid substratet bildas ett bakre lamellipodium under det och skjuter mekaniskt det första lamellipodiet mot den övre ventrala ytan. Aktinfilamenten i volangen som tidigare var parallella med substratet blir nu vinkelräta mot det, och volangen är nu placerad ovanför det framåtskridande lamellipodiet. Ruffle som rör sig bakåt faller tillbaka i cytosolen och representerar en cellulär mekanism för återvinning av lamellipodial ^aktin9,10.

Här beskriver vi en analys för mätning av cellkantsutsprångsdynamik. Utskjutningsanalysen använder time-lapse-videomikroskopi för att mäta utskjutningsdynamiken med en enda cellkant i 10 minuter under cellens spridningsfas. Utskjutningsdynamiken analyseras genom att generera kymografer från dessa filmer. I princip ger en kymograf detaljerade kvantitativa data om rörliga partiklar i ett spatiotemporalt diagram för att ge en kvalitativ förståelse av cellkantdynamiken. Intensiteten hos den rörliga partikeln ritas för alla bildstaplar i ett tids- kontra rymddiagram, där X-axeln respektive Y-axeln representerar tid och ^avstånd11. Denna metod använder en manuell kymografanalys med ImageJ för att få detaljerade kvantitativa data, vilket gör det möjligt att hämta information från filmer och bilder vid lågt signal-brusförhållande och / eller hög funktionsdensitet och analys av bilder som förvärvats i faskontrastljusmikroskopi eller dålig bildkvalitet.

Cellkantsutskjutningsdynamikanalysen som beskrivs här är en snabb, enkel och kostnadseffektiv metod. Som sådan, och eftersom det har visat sig direkt korrelera med cellmigration11,12, kan det användas som en preliminär metod för att testa cytoskelettdynamik som är involverad i cellmotilitet innan man bestämmer sig för att utföra mer resurskrävande metoder. Dessutom möjliggör det också kvantitativ mätning av hur genetiska manipulationer (knockout, knockdown eller räddningskonstruktioner) av cytoskelettproteiner påverkar cytoskelettdynamiken med hjälp av en enkel plattform. Analysen är en lärorik modell för att utforska cytoskelettdynamik i samband med cellmigration och kan användas för att belysa de mekanismer och molekyler som ligger bakom cellmotilitet.

Protocol

Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella Djurvårds- och användningskommittén (IACUC) vid Bar-Ilan University. OBS: En steg-för-steg-grafisk bild av proceduren som beskrivs i detta avsnitt visas i figur 1. 1. Cellodling OBS: Cellerna som används i protokollet är musembryonal fibroblaster (MEF) som genererades från E11.5-13.5 embryon av vild typ C57B…

Representative Results

I experimentet som beskrivs i figur 2 pläterades odödliga MEF på glasbottenskålar förbelagda med fibronektin för att aktivera integrinmedierad signalering, blockerad av denaturerad BSA, för att blockera fria potentiella platser för cellvidhäftning som inte är beroende av integrinaktivering. För att nå den logaritmiska tillväxtfasen vid 70% -80% sammanflöde av celler på experimentdagen pläterades 0,7 x 106 MEF i en vävnadsodlingsplatta med en diameter på 10 cm 16 …

Discussion

Cellkantsutsprångsdynamik, bestående av utsprång, indragningar och volanger, är både en förutsättning och en potentiell hastighetsbegränsande händelse i cellmotilitet. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att mäta dynamiken i cellkantsutsprång under spridning. Denna metod möjliggör kortvarig avbildning, genererar en betydande mängd data, kräver inte fluorescerande märkning av celler eller dyr fluorescerande mikroskopiutrustning och kan användas som en preliminär metod för att testa cytoskele…

Materials

10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A