पूरे भ्रूण संस्कृति के लिए एक बढ़ाया मंच छह दिनों तक पोस्टइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण के निरंतर और मजबूत पूर्व गर्भाशय विकास की अनुमति देता है, प्रीगैस्ट्रुलेशन चरणों से उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस तक। इस प्रोटोकॉल में, हम स्थैतिक प्लेटों और घूर्णन बोतल प्रणालियों का उपयोग करके सफल भ्रूण संस्कृति के लिए मानक प्रक्रिया का विस्तार करते हैं।
पोस्टइम्प्लांटेशन स्तनधारी भ्रूण संस्कृति विधियां आम तौर पर अक्षम रही हैं और गर्भाशय से बाहर विच्छेदन के बाद संक्षिप्त अवधि तक सीमित हैं। प्लेटफार्मों को हाल ही में उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस तक अंडे-सिलेंडर चरणों से माउस भ्रूण की अत्यधिक मजबूत और लंबे समय तक पूर्व गर्भाशय संस्कृति के लिए विकसित किया गया है। ये प्लेटफ़ॉर्म हिंद अंग गठन चरण (E11) तक pregastrulating भ्रूण (E5.5) के उचित और वफादार विकास को सक्षम करते हैं। देर से gastrulating भ्रूण (E7.5) इन सेटिंग्स में घूर्णन बोतलों में उगाया जाता है, जबकि pregastrulation चरणों (E5.5 या E6.5) से विस्तारित संस्कृति को स्थैतिक और घूर्णन बोतल संस्कृतियों के संयोजन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, O2 और CO2 एकाग्रता, गैस दबाव, ग्लूकोज के स्तर, और एक विशिष्ट पूर्व गर्भाशय संस्कृति माध्यम का उपयोग का संवेदनशील विनियमन उचित भ्रूण विकास के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, विस्तारित पूर्व गर्भाशय माउस भ्रूण संस्कृति के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। सामान्य माउस भ्रूण को विकसित करने की क्षमता गैस्ट्रुलेशन से ऑर्गेनोजेनेसिस तक पूर्व गर्भाशय भ्रूण विकास के दौरान विभिन्न प्रयोगात्मक गड़बड़ी के प्रभाव की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।
स्तनधारी भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास ने पोस्टइम्प्लांटेशन विकास के शुरुआती चरणों के अध्ययन को सीमित कर दिया है1,2। विकासशील भ्रूण की दुर्गमता गर्भाशय में भ्रूण प्रत्यारोपण के बाद होने वाली प्रमुख विकास प्रक्रियाओं की समझ को बाधित करती है, जैसे कि पशु शरीर की योजना की स्थापना, रोगाणु परतों का विनिर्देश, या ऊतकों और अंगों का गठन। इसके अलावा, प्रारंभिक पोस्टरिप्लांटेड भ्रूण का बहुत छोटा आकार ई 103 से पहले गर्भाशय में इंट्रावाइटल इमेजिंग द्वारा निरीक्षण करना मुश्किल बनाता है। इन चरणों में जीवित भ्रूणों का निरीक्षण करने और हेरफेर करने में असमर्थता ने विकास के दौरान स्नैपशॉट के लिए प्रारंभिक पोस्टइम्प्लांटेशन भ्रूणजनन के अध्ययन को सीमित कर दिया है।
प्रीइम्प्लांटेशन स्तनधारी भ्रूण की इन विट्रो संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित, विश्वसनीय और नियमित रूप से उपयोग किए जाते हैं4। फिर भी, उचित स्तनधारी पोस्टइम्प्लांटेशन भ्रूण विकास का समर्थन करने में सक्षम पूर्व गर्भाशय संस्कृति प्रणालियों को स्थापित करने के प्रयासों में सीमित सफलता मिली। एक सदी से अधिक समय से विभिन्न संस्कृति तकनीकों का प्रस्ताव किया गया है, मुख्य रूप से पारंपरिक स्थैतिक प्लेटों 6,7,8 या घूर्णन बोतलों (रोलर संस्कृतियों) 5,9,10 में भ्रूण को संवर्धित करके। ये प्लेटफ़ॉर्म सामान्य भ्रूण अस्तित्व के लिए अत्यधिक अक्षम होने और छोटी अवधि तक सीमित होने के बावजूद, आरोपण 11,12 के बाद स्तनधारी विकास पर ज्ञान का विस्तार करने में सहायक साबित हुए। भ्रूण ने संस्कृति दीक्षा के बाद 24-48 घंटे की शुरुआत में विकासात्मक मंदता और रूपात्मक विसंगतियों को प्रदर्शित करना शुरू कर दिया।
यह अध्ययन पूर्व गर्भाशय भ्रूण संस्कृति प्रणाली की स्थापना के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है जो प्रीगैस्ट्रुलेशन से उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस चरणों तक निरंतर विकास की अनुमति देता है, जो पोस्टइम्प्लांटेशन विकास के छह दिनों तक होता है। यह पेपर बेहतर रोलर संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो ई 7.5 भ्रूण (तंत्रिका प्लेट और हेडफोल्ड-स्टेज) के विकास का समर्थन करता है जब तक कि हिंद अंग गठन चरण (~ E11) और स्थिर प्लेटों और रोलर संस्कृति प्लेटफार्मों पर संस्कृति के संयोजन से E5.5 / E6.5 से विस्तारित संस्कृति।
यहां प्रस्तुत संस्कृति प्रोटोकॉल E5.5 से E11 तक छह दिनों तक उचित और निरंतर माउस भ्रूण विकास पूर्व गर्भाशय को बनाए रख सकता है। पहले, इन विकासात्मक चरणों में भ्रूण केवल छोटी अवधि (48 ज तक) 15 के लिए सं?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को पास्कल और इलाना मंटोक्स द्वारा वित्त पोषित किया गया था; यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान परिषद (FAMRI); इज़राइल कैंसर रिसर्च फंड (आईसीआरएफ) प्रोफेसरशिप, बीएसएफ, हेलेन और मार्टिन किमेल इंस्टीट्यूट फॉर स्टेम सेल रिसर्च, हेलेन और मार्टिन किमेल अवार्ड फॉर इनोवेटिव इन्वेस्टिगेशन; इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ), मिनर्वा, औषधीय रसायन विज्ञान के लिए शर्मन संस्थान, नेला और लियोन बेनोज़ियो न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए केंद्र, डेविड और फेला शेपेल फैमिली सेंटर फॉर जेनेटिक डिसऑर्डर रिसर्च, केकस्ट फैमिली इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल जेनेटिक्स, डॉ बेथ रोम-राइमर स्टेम सेल रिसर्च फंड, एडमंड डी रोथ्सचाइल्ड फाउंडेशन, ज़ंटकर चैरिटेबल फाउंडेशन, ज़विया ज़ीरोनी की संपत्ति।
0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
DMEM | GIBCO | 11880 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
HEPES | GIBCO | 15630056 | |
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |