Cromatografia semi-mirata ad altissime prestazioni accoppiata all'analisi spettrometrica di massa di metaboliti fenolici nel plasma di anziani
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare metaboliti fenolici nel plasma utilizzando un metodo di cromatografia-spettrometria di massa semi-mirato.
Abstract
A un gruppo di 23 persone anziane sono stati somministrati pasti funzionali (una bevanda e un muffin) appositamente formulati per la prevenzione della sarcopenia (perdita di massa muscolare legata all’età). I campioni di plasma sono stati prelevati all’inizio dell’intervento e dopo 30 giorni di consumo dei pasti funzionali. È stata effettuata una cromatografia semi-mirata ad altissime prestazioni abbinata all’analisi di massa tandem (UPLC-MS/MS) per identificare i composti fenolici e i loro metaboliti. Le proteine plasmatiche sono state precipitate con etanolo e i campioni sono stati concentrati e risospesi nella fase mobile (acetonitrile 1:1: acqua) prima dell’iniezione nello strumento UPLC-MS/MS. La separazione è stata effettuata con una colonna di fase inversa C18 e i composti sono stati identificati utilizzando la loro massa sperimentale, la distribuzione isotopica e il modello di frammento. I composti di interesse sono stati confrontati con quelli delle banche dati e della libreria semi-mirata interna. I risultati preliminari hanno mostrato che i principali metaboliti identificati dopo l’intervento erano acido fenilacetico, glicina, acido 3-idrossifenilvalerico e gomisina M2.
Introduction
La sarcopenia è un disturbo scheletrico progressivo correlato ad una perdita accelerata di muscoli nella popolazione anziana. Questa condizione aumenta il rischio di cadute e porta a attività limitate della vita quotidiana. La sarcopenia è presente in circa il 5%-10% delle persone di età superiore ai 65 anni e in circa il 50% delle persone di età pari o superiore a 80 anni1. Non sono stati approvati farmaci specifici per il trattamento della sarcopenia, quindi la prevenzione con l’attività fisica e una dieta equilibrata è importante1,2. Gli interventi nutrizionali con alimenti appositamente formulati arricchiti con proteine del latte e aminoacidi essenziali hanno mostrato risultati positivi nella prevenzione della sarcopenia2. In altri studi, gli autori hanno incluso vitamine e antiossidanti, come la vitamina E e gli isoflavoni, nella dieta, aumentando i benefici per il guadagno muscolare sulla vita e sui fianchi3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) è un albero che cresce nelle regioni tropicali messicane; è stato consumato dalle culture Maya grazie al suo alto valore nutrizionale4. È una buona fonte di proteine, fibre, minerali e antiossidanti fenolici, come l’acido clorogenico5. Poiché può essere macinato in polvere e utilizzato nei prodotti da forno o consumato nelle bevande, studi recenti hanno valutato l’incorporazione della farina di semi di Ramón (RSF) in diversi alimenti per migliorare il loro valore nutrizionale. È stata formulata una bevanda al gusto di cappuccino integrata con RSF, che era ricca di fibre alimentari e aveva più di 6 g di proteine per porzione, ed era altamente accettata dai consumatori; pertanto, è stata considerata una potenziale alternativa per soddisfare esigenze dietetiche speciali6. In uno studio di follow-up, RSF è stato utilizzato anche per formulare un muffin e una nuova bevanda ricca di proteine, fibre alimentari, micronutrienti e antiossidanti fenolici. Il muffin e la bevanda sono stati utilizzati in un intervento dietetico per le persone anziane, che hanno consumato entrambi i prodotti due volte al giorno per 30 giorni. Dopo questo periodo, lo stato nutrizionale e sarcopenico dei partecipanti è migliorato e il contenuto fenolico totale del plasma è aumentato7. Tuttavia, la determinazione dei composti fenolici totali nel plasma è stata effettuata con un metodo spettrofotometrico, quindi l’identificazione dei composti fenolici effettivi che sono stati assorbiti non è stata possibile; inoltre, questo metodo non è completamente specifico per i composti fenolici, quindi può verificarsi una sovrastima8.
L’identificazione e la quantificazione dei composti fenolici che vengono assorbiti dopo il consumo di alimenti ricchi di questi antiossidanti è un compito difficile ma è necessario per dimostrare l’attività biologica di questi fitochimici. La biodisponibilità della maggior parte dei composti fenolici è bassa; meno del 5% di essi può essere trovato senza trasformazione strutturale nel plasma. I composti fenolici subiscono diverse biotrasformazioni, come la metilazione, la solfonazione o la glucuronidazione, che vengono effettuate da enterociti ed epatociti9. I composti fenolici sono anche biotrasformati dal microbiota in cataboliti batterici che possono esercitare i loro effetti benefici nel corpo dopo essere stati assorbiti nel plasma10. Ad esempio, l’acido fenilacetico è un prodotto della trasformazione batterica dei flavonoidi e delle proantocianidine oligomeriche, che possono inibire fino al 40% dell’adesione dei batteri (Escherichia coli) nel tratto urinario dopo il consumo di mirtilli11.
La diversità strutturale dei composti fenolici presenti in natura, aggiunta alla diversità dei loro metaboliti e alla loro bassa biodisponibilità, rende la loro identificazione nel plasma ancora più difficile. La profilazione metabolomica, utilizzando piattaforme di analisi spettroscopica come la risonanza magnetica nucleare (NMR) e la spettroscopia di massa tandem (MS/MS), è probabilmente l’approccio migliore per raggiungere questo obiettivo; sfortunatamente, l’apparecchiatura non è facilmente accessibile e lo sviluppo di protocolli di analisi è ancora limitato12. Diversi studi hanno riportato MS / MS accoppiato con un sistema di separazione (come la cromatografia liquida) come strategia per ridurre la complessità degli spettri di massa negli studi metabolomici. La recente introduzione di metodi di separazione per cromatografia liquida (UPLC) ad altissime prestazioni ha ridotto il tempo di analisi e aumentato la risoluzione e la sensibilità rispetto ai protocolli liquidi convenzionali ad alte prestazioni, pertanto i sistemi UPLC-MS/MS sono stati rapidamente ampiamente accettati dalla comunità della metabolomica analitica13. In questo modo, alcuni studi hanno studiato metaboliti fenolici e rilevato derivati glucuronidati dall’acido caffeico, quercetina e acido ferulico, nonché derivati solfonati dall’acido siringico e vanillico nel plasma di individui dopo l’assunzione di mirtilli rossi14. I protocolli precedenti hanno lo scopo di trovare composti fenolici e metaboliti fenolici in biofluidi come il plasma. Questi protocolli si basavano sull’identificazione e la quantificazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata a un rivelatore UV-vis15. Tuttavia, tali protocolli richiedono l’uso di standard autentici per valutare l’identificazione assoluta e la quantificazione accurata. Una vasta gamma di studi ha identificato i metaboliti più comuni nei biofluidi (forme solfonate, glucuronidate e metilate) mediante UPLC-MS e UPLC-MS/MS; tuttavia, gran parte dei metaboliti batterici non è stata segnalata a causa della mancanza di database che contengano le loro informazioni complete16. L’identificazione dei metaboliti è complicata dal costo e dalla disponibilità commerciale degli standard dei metaboliti. Pertanto, la strategia migliore può essere l’analisi dei metaboliti MS/MS non mirata o semi-mirata, che si basa sull’uso di informazioni sulle caratteristiche molecolari (m/z, massa esatta monoisotopica, distribuzione isotopica e modello di frammentazione) per determinare l’identità chimica e confrontarla con database online liberamente disponibili che contengono metaboliti polifenolici identificati nei biofluidi dopo il consumo di polipolifenoli-ricchi12 . I database più importanti utilizzati negli studi UPLC-MS/MS per l’identificazione di composti fenolici e dei loro metaboliti sono il Database del Metaboloma Umano (HMDB), lipidBlast Library, METLIN Library e altri database complementari, come PubChem, ChemSpider e Phenol Explorer17.
Nel presente studio, è stato sviluppato un metodo UPLC-MS/MS semi-mirato per analizzare i campioni di plasma del gruppo di persone anziane coinvolte nello studio sul consumo di muffin e bevande contenenti RSF7. I dati provenienti da diversi database online gratuiti di metaboliti plasmatici sono stati raccolti e integrati in un database specializzato. Questo database è accessibile automaticamente dal software dell’apparecchiatura per identificare i metaboliti polifenolici nei cinque campioni di plasma prima e dopo l’intervento nutrizionale di 30 giorni. Questo viene fatto per identificare i principali composti fenolici, o i loro metaboliti, che vengono assorbiti dagli alimenti funzionali appositamente formulati progettati per la prevenzione della sarcopenia.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’identificazione e la quantificazione dei fitochimici bioattivi che vengono assorbiti dopo il consumo di un alimento o di un integratore alimentare sono cruciali per dimostrare e comprendere i benefici per la salute di questi composti e degli alimenti che li contengono. Nel presente lavoro è stato sviluppato il metodo UPLC-MS/MS, finalizzato unicamente all’identificazione dei principali composti fenolici e dei loro metaboliti che sono aumentati di concentrazione nel plasma dopo un intervento nutrizionale di 30 giorni c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati per il sostegno finanziario di CONACYT, Messico (CB- 2016-01-286449) e UACJ-PIVA (Progetti 313-17-16 e 335-18-13). OAMB desidera ringraziare CONACYT per la sua borsa di studio di dottorato. Il supporto tecnico dell’ufficio di produzione multimediale di UACJ è grato.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Referências
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