Semi-målrettet ultra-højtydende kromatografi koblet til massespektrometrianalyse af phenolmetabolitter i plasma hos ældre voksne
Summary
Målet med denne protokol er at detektere phenolmetabolitter i plasma ved hjælp af en semi-målrettet kromatografi-masse spektrometri metode.
Abstract
En gruppe på 23 ældre fik funktionelle måltider (en drik og en muffin) specielt formuleret til forebyggelse af sarkopeni (aldersrelateret tab af muskelmasse). Plasmaprøver blev taget i begyndelsen af interventionen og efter 30 dages indtagelse af de funktionelle måltider. En semi-målrettet ultra-højtydende kromatografi kombineret med tandemmasse (UPLC-MS/ MS) analyse blev udført for at identificere phenolforbindelser og deres metabolitter. Plasmaproteiner blev udfældet med ethanol, og prøverne blev koncentreret og resuspenderet i den mobile fase (1:1 acetonitril: vand) før injektion i UPLC-MS/MS-instrumentet. Adskillelse blev udført med en C18 omvendt fase kolonne, og forbindelser blev identificeret ved hjælp af deres eksperimentelle masse, isotopfordeling og fragmentmønster. Forbindelser af interesse blev sammenlignet med databanker og det interne semi-målrettede bibliotek. Foreløbige resultater viste, at de vigtigste metabolitter, der blev identificeret efter interventionen, var phenyleddikesyre, glycitin, 3-hydroxyphenylvalerinsyre og gomisin M2.
Introduction
Sarkopeni er en progressiv skeletlidelse relateret til et accelereret tab af muskler i den ældre befolkning. Denne tilstand øger risikoen for fald og fører til begrænsede aktiviteter i dagligdagen. Sarkopeni er til stede hos ca. 5-10 % af personer over 65 år og ca. 50 % af personer i alderen 80 år eller derover1. Der er ikke godkendt specifikke lægemidler til behandling af sarkopeni, så forebyggelse med fysisk aktivitet og en velafbalanceret kost er vigtig1,2. Ernæringsmæssige interventioner med specielt formulerede fødevarer beriget med mælkeprotein og essentielle aminosyrer har vist positive resultater til forebyggelse af sarkopeni2. I andre undersøgelser har forfattere inkluderet vitaminer og antioxidanter, som E-vitamin og isoflavoner, i kosten, hvilket øger fordelene for muskelforøgelse i taljen og hofterne3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) er et træ, der vokser i de mexicanske tropiske regioner; det er blevet indtaget af mayakulturer på grund af dets høje næringsværdi4. Det er en god kilde til protein, fiber, mineraler og phenolantioxidanter, såsom chlorogen syre5. Da det kan formales til pulver og anvendes i bageprodukter eller indtages i drikkevarer, har nylige undersøgelser evalueret inkorporeringen af Ramón-frømel (RSF) i forskellige fødevarer for at forbedre deres næringsværdi. En RSF-suppleret cappuccino-aromatiseret drik blev formuleret, som var høj i kostfiber og havde mere end 6 g protein pr. Portion og blev meget accepteret af forbrugerne; det blev således betragtet som et potentielt alternativ til at opfylde særlige kostbehov6. I en opfølgende undersøgelse blev RSF også brugt til at formulere en muffin og en ny drik rig på protein, kostfiber, mikronæringsstoffer og phenolantioxidanter. Muffin og drik blev brugt i en diætintervention for ældre personer, der indtog begge produkter to gange om dagen i 30 dage. Efter denne periode blev deltagernes ernæringsmæssige og sarkopeniske status forbedret, og det samlede phenolindhold i plasma steg7. Bestemmelsen af totale phenolforbindelser i plasma blev imidlertid udført ved en spektrofotometrisk metode, så identifikation af de faktiske phenolforbindelser, der blev absorberet, var ikke mulig; Desuden er denne metode ikke helt specifik for phenolforbindelser, så der kan forekomme en vis overvurdering8.
Identifikation og kvantificering af phenolforbindelserne, der absorberes efter indtagelse af fødevarer, der er rige på disse antioxidanter, er en vanskelig opgave, men er nødvendig for at demonstrere den biologiske aktivitet af disse fytokemikalier. Biotilgængeligheden af de fleste phenolforbindelser er lav; mindre end 5% af dem kan findes uden strukturel transformation i plasma. Phenolforbindelser gennemgår flere biotransformationer, såsom methylering, sulfonering eller glucuronidation, som udføres af enterocytter og hepatocytter9. Fenolforbindelser biotransformeres også af mikrobiotaen til bakterielle katabolitter, der kan udøve deres gavnlige virkninger i kroppen efter at være blevet absorberet i plasmaet10. For eksempel er phenyleddikesyre et produkt af bakteriel transformation af flavonoider og oligomere proanthocyanidiner, som kan hæmme op til 40% af bakteriernes (Escherichia coli) vedhæftning i urinvejene efter tranebærforbrug11.
Den strukturelle mangfoldighed af naturligt forekommende phenolforbindelser, tilsat mangfoldigheden af deres metabolitter og deres lave biotilgængelighed, gør deres identifikation i plasma endnu mere udfordrende. Metabolomisk profilering ved hjælp af spektroskopiske analyseplatforme som nuklear magnetisk resonans (NMR) og tandemmassespektroskopi (MS / MS) er sandsynligvis den bedste tilgang til at nå dette mål; Desværre er udstyret ikke let tilgængeligt, og udviklingen af analyseprotokoller er stadig begrænset12. Flere undersøgelser har rapporteret MS/MS kombineret med et separationssystem (såsom væskekromatografi) som en strategi til at reducere kompleksiteten af massespektre i metabolomiske undersøgelser. Den nylige introduktion af UPLC-separationsmetoder (ultra-high-performance liquid chromatography) har reduceret analysetiden og øget opløsningen og følsomheden sammenlignet med konventionelle højtydende væskeprotokoller, så UPLC-MS/MS-systemer er hurtigt blevet bredt accepteret af det analytiske metabolomics-samfund13. På denne måde har nogle undersøgelser undersøgt phenolmetabolitter og påvist glucuroniderede derivater fra koffeinsyre, quercetin og ferulinsyre samt sulfonerede derivater fra syringinsyre og vanillsyre i plasmaet hos individer efter tranebærindtagelse14. Tidligere protokoller har haft til formål at finde phenolforbindelser og phenolmetabolitter i biofluider såsom plasma. Disse protokoller var baseret på identifikation og kvantificering ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) koblet til en UV-vis-detektor15. Ikke desto mindre kræver sådanne protokoller anvendelse af autentiske standarder til vurdering af absolut identifikation og nøjagtig kvantificering. En lang række undersøgelser har identificeret de mest almindelige metabolitter i biofluider (sulfonerede, glucuroniderede og methylerede former) af UPLC-MS og UPLC-MS / MS; En stor del af bakteriemetabolitterne er imidlertid ikke blevet indberettet på grund af manglen på databaser, der indeholder deres fuldstændige oplysninger16. Identifikation af metabolit kompliceres af omkostningerne ved og den kommercielle tilgængelighed af metabolitstandarder. Derfor kan den bedste strategi være ikke-målrettet eller semi-målrettet MS/MS-metabolitanalyse, som er afhængig af anvendelsen af molekylær funktionsinformation (m/z, monoisotopisk nøjagtig masse, isotopisk fordeling og fragmenteringsmønster) til at bestemme den kemiske identitet og sammenligne den med frit tilgængelige onlinedatabaser, der indeholder polyphenolmetabolitter identificeret i biofluider efter indtagelse af polypolyphenol-richts12 . De vigtigste databaser, der anvendes i UPLC-MS / MS-undersøgelser til identifikation af phenolforbindelser og deres metabolitter, er Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library og andre komplementære databaser, såsom PubChem, ChemSpider og Phenol Explorer17.
I den foreliggende undersøgelse blev der udviklet en semi-målrettet UPLC-MS/ MS-metode til at analysere plasmaprøverne fra gruppen af ældre personer, der var involveret i rsf-holdigt muffin- og drikkevareforbrugsstudie7. Data fra forskellige gratis online databaser over plasmametabolitter blev indsamlet og integreret i en specialiseret database. Denne database kan tilgås automatisk af udstyrssoftwaren til at identificere de polyfenoliske metabolitter i de fem plasmaprøver før og efter den 30-dages ernæringsmæssige intervention. Dette gøres for at identificere de vigtigste phenolforbindelser eller deres metabolitter, der absorberes fra de specielt formulerede funktionelle fødevarer designet til forebyggelse af sarkopeni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifikation og kvantificering af de bioaktive fytokemikalier, der absorberes efter indtagelse af en fødevare eller et kosttilskud, er afgørende for at påvise og forstå de sundhedsmæssige fordele ved disse forbindelser og de fødevarer, der indeholder dem. I det foreliggende arbejde blev UPLC-MS/MS-metoden udviklet, der kun havde til formål at identificere de vigtigste phenolforbindelser og deres metabolitter, der steg i koncentration i plasma efter en 30-dages ernæringsmæssig intervention med to fødevarer, de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for den økonomiske støtte fra CONACYT, Mexico (CB- 2016-01-286449) og UACJ-PIVA (projekt 313-17-16 og 335-18-13). OAMB ønsker at takke CONACYT for hans ph.d.-stipendium. Teknisk support fra Multimedia Production-kontoret fra UACJ er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Referências
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
