Halvriktad ultra-högpresterande kromatografi kopplad till masspektrometrianalys av fenolmetiter i plasma hos äldre vuxna
Summary
Målet med detta protokoll är att upptäcka fenolmetaboliter i plasma med hjälp av en halvriktad kromatografi-masspektrometrimetod.
Abstract
En grupp på 23 äldre personer fick funktionella måltider (en dryck och en muffins) speciellt formulerad för förebyggande av sarkopeni (åldersrelaterad förlust av muskelmassa). Plasmaprover togs i början av interventionen och efter 30 dagars konsumtion av funktionella måltider. En halvriktad ultra-högpresterande kromatografi i kombination med tandem massa (UPLC-MS/MS) analys utfördes för att identifiera fenolföreningar och deras metaboliter. Plasmaproteiner fälldes ut med etanol och proverna koncentrerades och återanvändes i den mobila fasen (1:1 acetonitril: vatten) före injektion i UPLC-MS/MS-instrumentet. Separation utfördes med en C18 omvänd fas kolumn, och föreningar identifierades med hjälp av deras experimentella massa, isotopisk fördelning och fragment mönster. Föreningar av intresse jämfördes med databankernas och det interna halvriktade bibliotekets. Preliminära resultat visade att de viktigaste metaboliterna som identifierades efter interventionen var fenylaktisk syra, glycitin, 3-hydroxyfenylvalersyra och gomisin M2.
Introduction
Sarkopeni är en progressiv skelettsjukdom relaterad till en accelererad muskelförlust hos den äldre befolkningen. Detta tillstånd ökar risken för fall och leder till begränsade aktiviteter i det dagliga livet. Sarkopeni förekommer hos cirka 5-10% av personer över 65 år och cirka 50% av personer i åldern 80 år eller äldre1. Inga specifika läkemedel har godkänts för behandling av sarkopeni, så förebyggande med fysisk aktivitet och en välbalanserad kost är viktigt1,2. Näringsmässiga interventioner med speciellt formulerade livsmedel berikade med mejeriprotein och essentiella aminosyror har visat positiva resultat för att förebygga sarkopeni2. I andra studier har författare inkluderat vitaminer och antioxidanter, som E-vitamin och isoflavoner, i kosten, vilket ökar fördelarna för muskelmassa på midjan och höfterna3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) är ett träd som växer i de mexikanska tropiska regionerna; Det har konsumerats av Maya kulturer på grund av dess höga näringsvärde4. Det är en bra källa till protein, fiber, mineraler, och fenoliska antioxidanter, såsom klorogensyra5. Eftersom det kan malas till pulver och användas i bakprodukter eller konsumeras i drycker, har nyligen genomförda studier utvärderat införlivandet av Ramón frömjöl (RSF) i olika livsmedel för att förbättra deras näringsvärde. En RSF-kompletterad cappuccino-smaksatt dryck formulerades, som var hög i kostfiber och hade mer än 6 g protein per portion, och var mycket accepterad av konsumenterna; Således ansågs det vara ett potentiellt alternativ för att uppfylla särskilda kostbehov6. I en uppföljande studie användes RSF också för att formulera en muffins och en ny dryck rik på protein, kostfiber, mikronäringsfariter och fenoliska antioxidanter. Muffins och dryck användes i en diet intervention för äldre individer, som konsumerade båda produkterna två gånger per dag i 30 dagar. Efter denna period förbättrades deltagarnas näringsmässiga och sarkopeniska status och det totala fenolinnehållet i plasma ökade7. Bestämning av totala fenolföreningar i plasma utfördes dock med en spektrofotometrisk metod, så identifiering av de faktiska fenolföreningarna som absorberades var dock inte möjlig. Dessutom är denna metod inte helt specifik för fenolföreningar, så viss överskattning kan uppstå8.
Identifiering och kvantifiering av de fenolföreningar som absorberas efter konsumtion av livsmedel som är rika på dessa antioxidanter är en svår uppgift men är nödvändig för att visa den biologiska aktiviteten hos dessa fytokemikalier. Biotillgängligheten hos de flesta fenolföreningar är låg; mindre än 5% av dem kan hittas utan strukturell omvandling i plasma. Fenolföreningar genomgår flera biotransformationer, såsom metylering, sulfonation eller glukuronidation, som utförs av enterocyter och hepatocyter9. Fenolföreningar är också biotransformerade av mikrobiotan till bakteriella kataboliter som kan utöva sina positiva effekter i kroppen efter att ha absorberats i plasma10. Till exempel är fenylaktisk syra en produkt av bakteriell omvandling av flavonoider och oligomeriska proanthocyanidiner, vilket kan hämma upp till 40% av bakterierna (Escherichia coli) vidhäftning i urinvägarna efter tranbärskonsumtion11.
Den strukturella mångfalden av naturligt förekommande fenolföreningar, som läggs till mångfalden av deras metaboliter och deras låga biotillgänglighet, gör deras identifiering i plasma ännu mer utmanande. Metabolomisk profilering, med hjälp av spektroskopiska analysplattformar som kärnmagnetisk resonans (NMR) och tandemmasspektroskopi (MS/MS), är förmodligen det bästa tillvägagångssättet för att uppnå detta mål. Tyvärr är utrustningen inte lättillgänglig, och utvecklingen av analysprotokoll är fortfarande begränsad12. Flera studier har rapporterat MS/MS i kombination med ett separationssystem (såsom vätskekromatografi) som en strategi för att minska komplexiteten i masspektra i metabolomiska studier. Den senaste introduktionen av ultra-högpresterande vätskekromatografi (UPLC) separationsmetoder har minskat tiden för analys och ökat upplösningen och känsligheten jämfört med konventionella högpresterande vätskeprotokoll, så UPLC-MS / MS-system har snabbt accepterats allmänt av den analytiska metabolomikgemenskapen13. På detta sätt har vissa studier undersökt fenolmetaboliter och upptäckt glukuronidated derivat från koffeinsyra, quercetin och ferulsyra, samt sulfonerade derivat från syringsyra och vanillsyra i plasma av individer efter tranbär intag14. Tidigare protokoll har varit avsedda att hitta fenolföreningar och fenolmetaboliter i biofluider som plasma. Dessa protokoll baserades på identifiering och kvantifiering av högpresterande flytande kromatografi (HPLC) kopplad till en UV-vis detektor15. Sådana protokoll kräver dock användning av autentiska standarder för att bedöma absolut identifiering och korrekt kvantifiering. Ett brett spektrum av studier har identifierat de vanligaste metaboliterna i biofluider (sulfonerade, glukuronidated och metylerade former) av UPLC-MS och UPLC-MS/MS. En stor del av bakteriemetaboliterna har dock inte rapporterats på grund av bristen på databaser som innehåller deras fullständiga information16. Metabolitidentifiering kompliceras av kostnaden och kommersiell tillgänglighet av metabolitstandarder. Därför kan den bästa strategin vara oriktad eller halvriktad MS/MS-metabolitanalys, som bygger på användning av molekylär funktionsinformation (m/z, monoisotopic exakt massa, isotopfördelning och fragmenteringsmönster) för att bestämma den kemiska identiteten och jämför den med fritt tillgängliga onlinedatabaser som innehåller polyfenolmetaboliter som identifieras i biofluider efter konsumtion av polypolyfenolrikar12 . De viktigaste databaserna som används i UPLC-MS/MS-studier för identifiering av fenolföreningar och deras metaboliter är Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library och andra kompletterande databaser, såsom PubChem, ChemSpider och Phenol Explorer17.
I den aktuella studien utvecklades en halvriktad UPLC-MS/MS-metod för att analysera plasmaproverna från den grupp äldre personer som deltar i den RSF-innehållande muffin- och dryckeskonsumtionsstudien7. Data från olika gratis onlinedatabaser av plasmametaboliter samlades in och integrerades i en specialiserad databas. Denna databas kan nås automatiskt av utrustningsprogramvaran för att identifiera polyfenolmetaboliterna i de fem plasmaproverna före och efter 30-dagars näringsintervention. Detta görs för att identifiera de viktigaste fenolföreningarna, eller deras metaboliter, som absorberas från de speciellt formulerade funktionella livsmedel som är utformade för att förebygga sarkopeni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifiering och kvantifiering av de bioaktiva fytokemikalier som absorberas efter konsumtion av ett livsmedel eller kosttillskott är avgörande för att visa och förstå hälsofördelarna med dessa föreningar och de livsmedel som innehåller dem. I det nuvarande arbetet utvecklades UPLC-MS/MS-metoden, som endast syftade till identifiering av de viktigaste fenolföreningarna och deras metaboliter som ökade i koncentrationen i plasma efter en 30-dagars näringsintervention med två livsmedelsprodukter speciellt formu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma för det ekonomiska stödet från CONACYT, Mexiko (CB- 2016-01-286449) och UACJ-PIVA (Projekt 313-17-16 och 335-18-13). OAMB vill tacka CONACYT för hans doktorandstipendium. Teknisk support från Multimedia Production-kontoret från UACJ är tacksamt erkänd.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Referências
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
