Sticksårskademodell av Adult Optic Tectum med användning av zebrafisk och Medaka för jämförande analys av regenerativ kapacitet
Summary
En mekanisk hjärnskademodell hos vuxna zebrafiskar beskrivs för att undersöka de molekylära mekanismer som reglerar deras höga regenerativa kapacitet. Metoden förklarar att skapa en sticksårskada i optisk tektum hos flera arter av små fiskar för att utvärdera de regenerativa svaren med hjälp av fluorescerande immunfärgning.
Abstract
Medan zebrafiskar har en överlägsen förmåga att regenerera sitt centrala nervsystem (CNS), har medaka en lägre CNS-regenerativ kapacitet. En hjärnskademodell utvecklades i det vuxna optiska tektum hos zebrafiskar och medaka och jämförande histologiska och molekylära analyser utfördes för att belysa de molekylära mekanismerna som reglerar den höga regenerativa kapaciteten hos denna vävnad över dessa fiskarter. Här presenteras en sticksårskademodell för det vuxna optiska tektum med hjälp av en nål och histologiska analyser för proliferation och differentiering av neurala stamceller (NSC). En nål sattes manuellt in i den centrala regionen av optisk tektum, och sedan perfuserades fisken intrakardiellt och deras hjärnor dissekerades. Dessa vävnader kryosektionerades sedan och utvärderades med hjälp av immunfärgning mot lämpliga NSC-proliferations- och differentieringsmarkörer. Denna tektumskademodell ger robusta och reproducerbara resultat i både zebrafisk och medaka, vilket gör det möjligt att jämföra NSC-svar efter skada. Denna metod är tillgänglig för små teleoster, inklusive zebrafisk, medaka och afrikansk killifisk, och gör det möjligt för oss att jämföra deras regenerativa kapacitet och undersöka unika molekylära mekanismer.
Introduction
Zebrafiskar (Danio rerio) har en ökad förmåga att regenerera sitt centrala nervsystem (CNS) jämfört med andra däggdjur 1,2,3. För att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakom denna ökade regenerativa kapacitet har jämförande analyser av vävnadsregenerering med nästa generations sekvenseringsteknik utförts 4,5,6. Hjärnstrukturerna hos zebrafiskar och tetrapoder är ganska olika 7,8,9. Detta innebär att flera hjärnskademodeller med små fiskar med liknande hjärnstrukturer och biologiska egenskaper har utvecklats för att underlätta undersökningen av de underliggande molekylära mekanismerna som bidrar till denna ökade regenerativa kapacitet.
Dessutom är medaka (Oryzias latipes) ett populärt laboratoriedjur med låg kapacitet för hjärt- och neuronal regenerering10,11,12,13 jämfört med zebrafisk. Zebrafisk och medaka har liknande hjärnstrukturer och nischer för vuxna neurala stamceller (NSC)14,15,16,17. I zebrafisk och medaka innehåller det optiska tektum två typer av NSC, neuroepitelliknande stamceller och radiella gliaceller (RGCs)15,18. En sticksårskada för optisk tektum hos vuxna zebrafiskar utvecklades tidigare, och denna modell användes för att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar hjärnregenerering hos dessa djur 19,20,21,22,23. Denna unga vuxna zebrafisk sticka sårskada modell inducerade regenerativ neurogenes från RGC 19,24,25. Denna sticksårskada i optisk tektum är en robust och reproducerbar metod 13,19,20,21,22,23,24,25. När samma skademodell tillämpades på vuxen medaka avslöjades den låga neurogena kapaciteten hos RGC i medaka optisk tektum via jämförande analys av RGC-proliferation och differentiering efter skada13.
Sticksårskademodeller i optisk tektum har också utvecklats i mummigrismodeller26, men detaljer om tektumskadan har inte dokumenterats väl jämfört med telencefalisk skada27. Sticksårskadan i optisk tektum med zebrafisk och medaka möjliggör undersökning av differentiella cellulära svar och genuttryck mellan arter med differentiell regenerativ kapacitet. Detta protokoll beskriver hur man utför en sticksårskada i optisk tektum med hjälp av en injektionsnål. Denna metod kan tillämpas på små fiskar som zebrafisk och medaka. Processerna för provberedning för histologisk analys och cellulär proliferation och differentieringsanalys med fluorescerande immunhistokemi och kryosektioner förklaras här.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs en uppsättning metoder som kan användas för att inducera sticksårskador i optic tectum med hjälp av en nål för att underlätta utvärderingen av RGC-proliferation och differentiering efter hjärnskada. Nålmedierade sticksår är en enkel, effektivt implementerad metod som kan tillämpas på många experimentella prover med hjälp av en standarduppsättning verktyg. Sticksårskademodeller för flera regioner i zebrafiskhjärnan har utvecklats 3,19,29<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 och 21K15195 och ett internt bidrag från AIST, Japan.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
Referências
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Biologia do Desenvolvimento. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Biologia do Desenvolvimento. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Biologia do Desenvolvimento. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
