Une méthode de microdissection de l’oviducte de souris qui permet la collecte des segments individuels tout en maintenant l’intégrité de l’ARN est présentée. En outre, une procédure de dissociation des cellules oviductales non enzymatiques est décrite. Les méthodes sont appropriées pour l’analyse ultérieure des gènes et des protéines des segments oviductaux fonctionnellement différents et des cellules oviductales dissociées.
Les systèmes de modèles murins sont inégalés pour l’analyse des processus pathologiques en raison de leur manipulabilité génétique et du faible coût des traitements expérimentaux. Cependant, en raison de leur petite taille corporelle, certaines structures, telles que l’oviducte d’un diamètre de 200 à 400 μm, se sont avérées relativement difficiles à étudier, sauf par immunohistochimie. Récemment, des études immunohistochimiques ont révélé des différences plus complexes dans les segments d’oviductes que ce qui était reconnu auparavant; ainsi, l’oviducte est divisé en quatre segments fonctionnels avec des rapports différents de sept types de cellules épithéliales distinctes. Les différentes origines embryologiques et les ratios des types de cellules épithéliales rendent probablement les quatre régions fonctionnelles différentiellement sensibles à la maladie. Par exemple, les lésions précurseurs des carcinomes intraépithéliaux séreux proviennent de l’infundibulum dans les modèles murins et de la région fimbriale correspondante dans la trompe de Fallope humaine. Le protocole décrit ici détaille une méthode de microdissection pour subdiviser l’oviducte de manière à produire une quantité et une pureté suffisantes d’ARN nécessaires à l’analyse en aval, telles que la TRANSCRIPTION inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) et le séquençage de l’ARN (RNAseq). On décrit également une méthode de dissociation tissulaire principalement non enzymatique appropriée pour la cytométrie en flux ou l’analyse RNAseq unicellulaire de cellules oviductales entièrement différenciées. Les méthodes décrites faciliteront la poursuite des recherches utilisant l’oviducte murin dans le domaine de la reproduction, de la fertilité, du cancer et de l’immunologie.
L’oviducte murin a une fonction et une morphologie similaires à celles de la trompe de Fallope humaine1. Les deux sont constitués d’un épithélium cilié pseudostratifié, composé de deux cellules résidentes épithéliales décrites historiquement: les cellules ciliées et les cellules sécrétoires1,2. L’oviducte a trois segments classiquement reconnus: l’infundibulum, l’ampoule et l’isthme. Dans une étude récente, Harwalkar et al. 3 a étudié la morphologie des oviductes et l’expression des gènes conduisant à l’expansion de la catégorisation des cellules épithéliales résidentes à sept populations distinctes. En outre, ils ont établi la jonction ampullaire-isthme comme un segment distinct de l’oviducte3. La méthode décrite ici, qui se concentre sur l’infundibulum, l’ampoule et l’isthme, pourrait facilement être étendue pour inclure également la jonction ampullaire-isthmique2,3. La région infundibulaire contient l’ostium, ou ouverture de l’oviducte, et comprend la région fimbriale ainsi que la tige proximale. En se déplaçant vers l’utérus, vient ensuite l’ampoule, puis l’isthme. Les cellules ciliées sont les plus importantes à l’extrémité distale de la région, proximales de l’ovaire ou infundibulum, tandis que les cellules sécrétoires sont plus importantes à l’extrémité proximale ou au segment de l’isthme1. Contrairement à la trompe de Fallope humaine, l’oviducte murin est une structure enroulée soutenue par le mésoalpinx, une extension du large ligament péritoine1,4. De plus, l’oviducte de souris est enfermé dans un sac de bourse qui augmente la probabilité de transfert d’ovocytes dans l’oviducte4. L’ampoule est identifiée comme le lieu de fécondation, à partir duquel les embryons en développement passent dans l’isthme avant d’entrer dans l’utérus5. Les segments tubaires ont un diamètre de 200 à 400 μm et les régions ampullaires et isthmes plus longues mesurent environ 0,5 à 1,0 cm de longueur4. Les distédes d’oviductes pendant le cycle œstral et l’ampoule et l’infundibulum sont plus dissemblables que l’isthme1.
La prolifération excessive des cellules, en particulier des cellules sécrétoires, caractérise les lésions précurseurs des tumeurs séreuses présentes dans la cavité pelvienne6. Ces lésions intraépithéliales séreuses précurseurs apparaissent dans l’épithélium de l’oviducte uniquement dans la région fimbriale; on ne sait pas pourquoi la formation de lésions est limitée à cette région où normalement le type de cellule prédominant est cilié, et non sécrétoire2,7,8. La régionalité en termes de fonction physiologique normale, ainsi que l’intérêt accru pour l’origine oviductale du cancer de l’ovaire9,10,11,12,13, soulignent l’importance d’une évaluation séparée des segments d’oviductes.
La méthode décrite ici détaille la collecte de segments oviductaux distincts pour des analyses ultérieures en aval de l’expression et de la fonction des gènes spécifiques à un segment des cellules dissociées. Traditionnellement, de nombreux tissus sont traités pour l’extraction de l’ARN entier en suivant soit la méthode du phénol: chloroforme ou une méthode d’extraction complète sur colonne; cependant, nous avons constaté que la qualité de l’ARN était maintenue tout en produisant un rendement suffisant avec la méthode de combinaison décrite. En utilisant cette méthode, de très petits segments fonctionnels de l’oviducte peuvent être traités pour des analyses en aval plutôt que d’étudier l’oviducte dans son ensemble, ce qui peut masquer des résultats représentatifs des différents segments14.
Les cellules oviductales murines dissociées ont rarement été étudiées par cytométrie en flux, probablement en raison de la limitation du rendement cellulaire de ce tissu. Une approche pour surmonter ce problème a été de dissocier les cellules, de les cultiver en culture, puis de stimuler la re-différenciation in vitro pour obtenir des nombres de cellules appropriés pour l’analyse cellulaire en aval15,16,17,18. Une limite à cette approche est le temps ex vivo et le microenvironnement altéré en culture, qui modifient probablement l’expression des gènes. On suppose également que la redifférection morphologique a la même signature transcriptionnelle et protéomique que celle présente chez l’animal intact. La méthode de dissociation actuelle a été conçue pour obtenir le plus grand nombre de cellules épithéliales dans une population de cellules oviductales hétérogènes tout en maintenant la différenciation unicellulaire. De plus, l’approche principalement non enzymatique limite probablement la perte de protéines de surface cellulaire.
Les trois segments de l’oviducte sont histologiquement, morphologiquement et fonctionnellement distincts1,2,3. L’épithélium varie considérablement d’une extrémité de l’oviducte à l’autre. Les cellules ciliées dominent à l’extrémité fimbriale/infundibulaire, tandis que les cellules sécrétoires dominent dans la région isthmique1. Bien que ce gradient global soit reconnu depuis un ce…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu en partie par un DoD Breakthrough Award à AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR a été partiellement soutenu par des bourses intra-muros: la bourse pré-doctorale Pease Cancer et la bourse pré-doctorale Mary Galvin Burden en sciences biomédicales et à l’Université de Californie, Riverside, des prix intra-muros: la subvention de recherche de thèse du Comité des bourses du Graduate Council et le prix du programme de l’année de thèse de la division des études supérieures. Les auteurs remercient Gillian M. Wright et Alyssa M. Kumari pour leur aide dans le dépannage précoce de cette méthode.
0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
25G needle | BD | 305122 | |
60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20C for dissection |
Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text. |
Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |