ניתוח מיקרו-דיסקט וניתוק של אובידוקט מורין: זיהוי מקטע בודד ובידוד תא בודד

Summary

מוצגת שיטה למיקרודיסקציה של oviduct העכבר המאפשרת איסוף של מקטעים בודדים תוך שמירה על שלמות RNA. בנוסף, הליך פירוק תאים oviductal לא אנזימטי מתואר. השיטות מתאימות לניתוח גנים וחלבון לאחר מכן של מקטעי oviductal שונים מבחינה תפקודית ותאי oviductal מנותקים.

Abstract

מערכות מודל עכבר הם ללא תחרות לניתוח של תהליכי מחלה בגלל manipulability הגנטית שלהם ואת העלות הנמוכה של טיפולים ניסיוניים. עם זאת, בגלל גודל הגוף הקטן שלהם, כמה מבנים, כגון oviduct עם קוטר של 200-400 מיקרומטר, הוכיחו להיות קשה יחסית ללמוד אלא על ידי immunohistochemistry. לאחרונה, מחקרים אימונוהיסטוכימיים חשפו הבדלים מורכבים יותר במגזרי oviduct מאשר היו מוכרים בעבר; לפיכך, האובידוקט מחולק לארבעה מקטעים פונקציונליים עם יחסים שונים של שבעה סוגי תאי אפיתל נפרדים. המקורות והיחסים העובריים השונים של סוגי תאי האפיתל עשויים להפוך את ארבעת האזורים התפקודיים לרגישים באופן דיפרנציאלי למחלות. לדוגמה, נגעים מבשרים לקרצינומות תוך-אפיתליות serous נובעים מהאינפובולום במודלים של עכברים ומהאיזור הפימברי המתאים בחצוצרה האנושית. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה עבור microdissection כדי לחלק את oviduct באופן כזה להניב כמות מספקת וטוהר של RNA הדרוש לניתוח במורד הזרם כגון תמלול הפוך-כמותי PCR (RT-qPCR) ורצף RNA (RNAseq). כמו כן מתוארת היא שיטת פירוק רקמות לא אנזימטית בעיקר המתאימה לציטומטריית זרימה או ניתוח RNAseq תא יחיד של תאים oviductal מובחנים לחלוטין. השיטות המתוארות יאפשרו מחקר נוסף תוך שימוש באובידוקט מורין בתחום הרבייה, הפוריות, הסרטן והאימונולוגיה.

Introduction

oviduct murine דומה בתפקוד ומורפולוגיה לחצוצרה ^{האנושית1}. שניהם מורכבים מאפיתל פסאודו-אסטרטגי, המורכב משני תאים מקומיים אפיתל המתוארים היסטורית: תאים מחוספסים ותאי הפרשה ^1,2. לאובידוקט שלושה קטעים מוכרים קלאסית: האינפונדיבולום, האמפולה והאיסתמוס. במחקר שנערך לאחרונה, Harwalkar ואח ‘. ³ חקר מורפולוגיה oviduct וביטוי גנים המוביל להרחבת הסיווג של תאי אפיתל תושב לשבע אוכלוסיות נפרדות. בנוסף, הם הקימו את צומת אמפולרי-איסתמוס כמקטע נפרד של oviduct3. השיטה המתוארת בזאת, המתמקדת אינפונדבולום, אמפולה, ו isthmus, יכול בקלות להיות מורחב לכלול את הצומת אמפולרי-איסתמי, כמו גם ^2,3. האזור הבלתי מוחרי מכיל את האוסטיום, או הפתיחה של oviduct, וכולל את האזור fimbrial, כמו גם את הגבעול הפרוקסימלי. נע לכיוון הרחם, הבא הוא אמפולה, ולאחר מכן isthmus. תאים מסוכסכים בולטים ביותר בקצה הדיסטלי של האזור, קרובים לשחלה, או אינפונבולום, בעוד שתאי הפרשה בולטים ביותר בקצה הפרוקסימלי או בקטע איסתמוס1. שלא כמו החצוצרה האנושית, oviduct murine הוא מבנה מפותל נתמך על ידי mesosalpinx, הרחבה של הרצועה הרחבה צפק ^1,4. בנוסף, oviduct העכבר עטוף בשק בורסל שמגדיל את הסבירות להעברת ביציות לתוך oviduct4. האמפולה מזוהה כמיקום ההפריה, שממנו עוברים מתפתחים עוברים לאיתמוס לפני הכניסה לרחם ⁵. מקטעי חצובות הם בקוטר 200-400 מיקרומטר ואזורי האמפולר והאיסתמוס הארוכים יותר הם כ 0.5-1.0 ס”מ ^אורך4. האובידוקט נחלש במהלך המחזור האסטרוס והאמפולה והאינדיבולום נפוחים יותר ^{מהאיתמוס1}.

התפשטות יתר של תאים, במיוחד תאים הפרשה, מאפיינים נגעים קודמים לגידולים סרוסיים שנמצאו בחלל ^האגן6. נגעים תוך-אפיתל-אפיתליים מבשרים אלה מתעוררים באפיתל האובידוקט אך ורק באזור הפימברי; לא ידוע מדוע היווצרות נגע מוגבלת לאזור זה שבו בדרך כלל סוג התא השולט הוא ciliated, לא הפרשה2,7,8. האזוריות במונחים של תפקוד פיזיולוגי נורמלי, כמו גם עניין מוגבר במקור oviductal של סרטן השחלות9,10,10,11,12,13, מדגיש את החשיבות של הערכה נפרדת של קטעי oviduct.

השיטה המתוארת כאן מפרטת את האוסף של מקטעי oviductal נפרדים לניתוחים במורד הזרם הבאים של ביטוי גנים ספציפיים למגזר ותפקוד של תאים מנותקים. באופן מסורתי, רקמות רבות מעובדות עבור מיצוי RNA שלם בעקבות הפנול: שיטת כלורופורם או שיטת מיצוי מלאה בעמודה; עם זאת, מצאנו כי איכות RNA נשמר תוך הפקת תשואה מספקת עם שיטת השילוב המתוארת. באמצעות שיטה זו, קטעים פונקציונליים קטנים מאוד של oviduct ניתן לעבד עבור ניתוחים במורד הזרם במקום לחקור את oviduct בכללותו, אשר יכול להסוות תוצאות נציג של המקטעים ^{השונים14}.

תאי אובידוקטלי מורין מנותקים נחקרו לעתים רחוקות על ידי ציטומטריית זרימה, ככל הנראה בשל תפוקת התא המגבילה מרקמה זו. גישה אחת כדי להתגבר על בעיה זו הייתה לנתק תאים, לגדל אותם בתרבית, ולאחר מכן לעורר בידול מחדש במבחנה כדי להשיג מספרי תאים מתאימים לניתוח תאים במורד הזרם15,16,17,18. מגבלה לגישה זו היא הזמן ex vivo ושינוי microenvironment בתרבות, שניהם עשויים לשנות ביטוי גנים. יש גם הנחה כי בידול מחדש מורפולוגי יש את אותה חתימה תמלולית פרוטאומית כפי שהיה נוכח בחיה שלמה. שיטת הניתוק הנוכחית תוכננה להשיג את המספר הגבוה ביותר של תאי אפיתל באוכלוסיית תאים אובידוקטליים הטרוגניים תוך שמירה על בידול תאים בודדים. יתר על כן, הגישה הלא אנזימטית בעיקר מגבילה ככל הנראה את אובדן חלבוני פני התא.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים והנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים ריברסייד והיו בהתאם להנחיות האגודה האמריקאית לטיפול בבעלי חיים במעבדה, מחלקת החקלאות של ארצות הברית ומכוני הבריאות הלאומיים. השיטה המתוארת השתמשה C57BL / 6 מבוגר, עכברים נקבות. כל בעלי הח?…

Representative Results

פרוטוקול הניתוק המתואר מניב 100,000-120,000 תאים לעכבר עם איגום של שני oviducts. השיטה עדינה מספיק כדי להשאיר את גבולות התאים הרב-תכליתיים ללא פגע, ומאפשרת הבחנה בין תאים מרובי סיבים לתאי הפרשה, ומוודאת ששיטת העיכול עדינה מספיק כדי למנוע דה-הבחנה. תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות באיור…

Discussion

שלושת המקטעים של האובידוקט הם היסטולוגיים, מורפולוגיים ונבדלים מבחינה תפקודית, ^1,2,3. האפיתל משתנה מאוד מקצה אחד של oviduct למשנהו. תאים מסוכסכים שולטים בקצה הפימברי/לא-מימון, בעוד שתאי הפרשה שולטים באזור האיסתמי1. בעוד שיפוע כולל …

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines