माइक्रोडिसेक्शन और म्यूरीन ओविडक्ट का पृथक्करण: व्यक्तिगत खंड पहचान और एकल सेल अलगाव
Summary
माउस ओविडक्ट के माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक विधि जो आरएनए अखंडता को बनाए रखते हुए व्यक्तिगत खंडों के संग्रह की अनुमति देती है, प्रस्तुत की जाती है। इसके अलावा, गैर-एंजाइमेटिक ओविडक्टल सेल पृथक्करण प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। विधियाँ कार्यात्मक रूप से अलग-अलग ओविडक्टल खंडों और विघटित ओविडक्टल कोशिकाओं के बाद के जीन और प्रोटीन विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
माउस मॉडल सिस्टम रोग प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बेजोड़ हैं क्योंकि उनकी आनुवंशिक मैनिपुलेबिलिटी और प्रयोगात्मक उपचार की कम लागत है। हालांकि, उनके छोटे शरीर के आकार के कारण, कुछ संरचनाएं, जैसे कि 200-400 μm के व्यास के साथ ओविडक्ट, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को छोड़कर अध्ययन करने के लिए अपेक्षाकृत कठिन साबित हुई हैं। हाल ही में, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययनों ने पहले से मान्यता प्राप्त की तुलना में ओविडक्ट सेगमेंट में अधिक जटिल अंतरों को उजागर किया है; इस प्रकार, ओविडक्ट को सात अलग-अलग उपकला सेल प्रकारों के विभिन्न अनुपातों के साथ चार कार्यात्मक खंडों में विभाजित किया गया है। उपकला सेल प्रकारों के विभिन्न भ्रूणीय मूल और अनुपात संभवतः चार कार्यात्मक क्षेत्रों को बीमारी के लिए अलग-अलग अतिसंवेदनशील बनाते हैं। उदाहरण के लिए, सीरस इंट्राएपिथेलियल कार्सिनोमा के अग्रदूत घाव माउस मॉडल में इनफंडिबुलम से और मानव फैलोपियन ट्यूब में संबंधित फिम्ब्रियल क्षेत्र से उत्पन्न होते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक आरएनए की पर्याप्त मात्रा और शुद्धता जैसे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) और आरएनए अनुक्रमण (आरएनएसेक) के लिए आवश्यक आरएनए की पर्याप्त मात्रा और शुद्धता उत्पन्न करने के लिए ओवीडक्ट को उप-विभाजित करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक विधि का विवरण दिया गया है। इसके अलावा वर्णित एक ज्यादातर गैर एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण विधि प्रवाह cytometry या पूरी तरह से विभेदित oviductal कोशिकाओं के एकल सेल RNAseq विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। वर्णित तरीके प्रजनन, प्रजनन क्षमता, कैंसर और इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में मुरीन ओविडक्ट का उपयोग करके आगे के शोध की सुविधा प्रदान करेंगे।
Introduction
मुरीन ओविडक्ट मानव फैलोपियन ट्यूब 1 के लिए कार्य और आकृति विज्ञान में समान है। दोनों में एक छद्म स्तरीकृत सिलिएटेड उपकला होती है, जिसमें दो ऐतिहासिक रूप से वर्णित उपकला निवासी कोशिकाएं होती हैं: सिलिएटेड कोशिकाएं और स्रावी कोशिकाएं 1,2। ओविडक्ट में तीन शास्त्रीय रूप से मान्यता प्राप्त खंड हैं: इनफंडिबुलम, एम्पुला और इस्थमस। हाल के एक अध्ययन में, हरवलकर एट अल। 3 ने ओविडक्ट आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति की जांच की, जिससे सात अलग-अलग आबादी के लिए निवासी उपकला कोशिकाओं के वर्गीकरण का विस्तार हुआ। इसके अलावा, उन्होंने एम्पुलेरी-इस्थमस जंक्शन को ओविडक्ट 3 के एक अलग खंड के रूप में स्थापित किया। यहां वर्णित विधि, जो इनफंडिबुलम, एम्पुला और इस्थमस पर केंद्रित है, को आसानी से एम्पुलरी-इस्थमिक जंक्शन के साथ-साथ 2,3 को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इनफंडिबुलर क्षेत्र में ऑस्टियम, या ओविडक्ट का उद्घाटन होता है, और इसमें फिम्ब्रियल क्षेत्र के साथ-साथ समीपस्थ डंठल भी शामिल होता है। गर्भाशय की ओर बढ़ते हुए, अगला एम्पुला है, और फिर इस्थमस। सिलिटेड कोशिकाएं क्षेत्र के डिस्टल छोर में सबसे प्रमुख होती हैं, अंडाशय के समीपस्थ, या इनफंडिबुलम के लिए, जबकि स्रावी कोशिकाएं समीपस्थ अंत या इस्थमस सेगमेंट 1 में सबसे प्रमुख होती हैं। मानव फैलोपियन ट्यूब के विपरीत, मुरीन ओविडक्ट मेसोसाल्पिंक्स द्वारा समर्थित एक कुंडलित संरचना है, जो व्यापक स्नायुबंधन पेरिटोनियम 1,4 का विस्तार है। इसके अलावा, माउस ओविडक्ट को एक बर्सल थैली में संलग्न किया जाता है जो ओविडक्ट 4 में ओसाइट स्थानांतरण की संभावना को बढ़ाता है। एम्पुला को निषेचन के स्थान के रूप में पहचाना जाता है, जिसमें से विकासशील भ्रूण गर्भाशय 5 में प्रवेश करने से पहले इस्थमस में गुजरते हैं। ट्यूबल खंड व्यास में 200-400 μm हैं और लंबे ampullary और इस्थमस क्षेत्रों की लंबाई लगभग 0.5-1.0 सेमी है। ओविडक्ट एस्ट्रोस चक्र के दौरान विघटित होता है और एम्पुला और इनफंडिबुलम इस्थमस 1 की तुलना में अधिक डिस्टेनेबल होते हैं।
कोशिकाओं के प्रसार पर, विशेष रूप से स्रावी कोशिकाएं, श्रोणि गुहा 6 में पाए जाने वाले सीरस ट्यूमर के अग्रदूत घावों की विशेषता है। ये अग्रदूत सीरस इंट्राएपिथेलियल घाव ओविडक्ट एपिथेलियम में पूरी तरह से फिम्ब्रियल क्षेत्र में उत्पन्न होते हैं; यह अज्ञात है कि घाव का गठन इस क्षेत्र तक सीमित क्यों है जहां आमतौर पर प्रमुख सेल प्रकार सिलिएट होता है, न कि स्रावी 2,7,8। सामान्य शारीरिक कार्य के संदर्भ में क्षेत्रीयता, साथ ही डिम्बग्रंथि के कैंसर 9,10,11,12,13 के ओविडक्टल मूल में बढ़ी हुई रुचि, ओविडक्ट खंडों के अलग-अलग मूल्यांकन के महत्व को रेखांकित करती है।
यहां वर्णित विधि खंड-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति और विघटित कोशिकाओं के कार्य के बाद के डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए अलग-अलग ओविडक्टल खंडों के संग्रह का विवरण देती है। परंपरागत रूप से, कई ऊतकों को या तो फिनोल के बाद पूरे आरएनए निष्कर्षण के लिए संसाधित किया जाता है: क्लोरोफॉर्म विधि या एक ऑन-कॉलम पूर्ण निष्कर्षण विधि; हालांकि, हमने पाया कि वर्णित संयोजन विधि के साथ पर्याप्त उपज का उत्पादन करते समय आरएनए गुणवत्ता को बनाए रखा गया था। इस विधि का उपयोग करते हुए, ओवीडक्ट के बहुत छोटे कार्यात्मक खंडों को पूरे के रूप में ओविडक्ट की जांच करने के बजाय डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है, जो विभिन्न खंडों के परिणामों के प्रतिनिधि को मुखौटा कर सकता है।
विघटित मुरीन ओविडक्टल कोशिकाओं को शायद ही कभी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जांच की गई है, सबसे अधिक संभावना इस ऊतक से सीमित सेल उपज के कारण। इस समस्या को दूर करने के लिए एक दृष्टिकोण कोशिकाओं को अलग करना, उन्हें संस्कृति में विकसित करना, और फिर डाउनस्ट्रीम सेल विश्लेषण 15,16,17,18 के लिए उपयुक्त सेल नंबर प्राप्त करने के लिए विट्रो में पुन: भेदभाव को प्रोत्साहित करना है। इस दृष्टिकोण की एक सीमा वह समय है जब पूर्व विवो और संस्कृति में माइक्रोएन्वायरमेंट को बदल दिया गया है, जिनमें से दोनों जीन अभिव्यक्ति को बदलने की संभावना रखते हैं। एक धारणा यह भी है कि रूपात्मक पुन: विभेदन में एक ही ट्रांसक्रिप्शनल और प्रोटिओमिक हस्ताक्षर होता है जो बरकरार जानवर में मौजूद था। वर्तमान पृथक्करण विधि को एकल सेल भेदभाव को बनाए रखते हुए एक विषमजनित ओवीडक्टल सेल आबादी में उपकला कोशिकाओं की उच्चतम संख्या को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसके अलावा, ज्यादातर गैर-एंजाइमेटिक दृष्टिकोण संभवतः सेल सतह प्रोटीन के नुकसान को सीमित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ओविडक्ट के तीन खंड हिस्टोलॉजिकल, रूपात्मक रूप से, और कार्यात्मक रूप से अलग-अलग हैं1,2,3। उपकला ओविडक्ट के एक छोर से दूसरे छोर तक बहुत भिन्न होती है। सिलिटेड कोशिकाएं फि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एएमडब्ल्यू (BCRP W81XWH-14-1-0425) के लिए एक DoD ब्रेकथ्रू अवार्ड द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। केसीआर को आंशिक रूप से इंट्राम्यूरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था: पीज़ कैंसर प्री-डॉक्टरेट फैलोशिप और मैरी गैल्विन बर्डन प्री-डॉक्टरेट फैलोशिप बायोमेडिकल साइंसेज और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड, इंट्राम्यूरल अवार्ड्स में मैरी गैल्विन बर्डन प्री-डॉक्टरल फैलोशिप फैलोशिप: ग्रेजुएट काउंसिल फैलोशिप कमेटी शोध प्रबंध अनुसंधान अनुदान और स्नातक डिवीजन शोध प्रबंध वर्ष कार्यक्रम पुरस्कार। लेखक इस विधि के शुरुआती समस्या निवारण में सहायता के लिए गिलियन एम राइट और एलिसा एम कुमारी को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text. |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
Referências
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