RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.
Fare modeli sistemleri, genetik manipülabillikleri ve deneysel tedavilerin maliyetinin düşük olması nedeniyle hastalık süreçlerinin analizi için eşsizdir. Bununla birlikte, küçük vücut boyutları nedeniyle, 200-400 μm çapındaki yumurta kanalı gibi bazı yapıların, immünhistokimya dışında incelenmesinin nispeten zor olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, immünohistokimyasal çalışmalar, yumurta kanalı segmentlerinde daha önce tanınandan daha karmaşık farklılıklar ortaya çıkarmıştır; böylece, yumurta kanalı yedi farklı epitel hücre tipinin farklı oranlarına sahip dört fonksiyonel segmente ayrılır. Epitel hücre tiplerinin farklı embriyolojik kökenleri ve oranları muhtemelen dört fonksiyonel bölgeyi hastalığa farklı olarak duyarlı hale getirir. Örneğin, seröz intraepithelial karsinomların öncü lezyonları fare modellerindeki infundibulumdan ve insan fallop tüpündeki ilgili fimbrial bölgeden kaynaklanır. Burada açıklanan protokol, mikrodiseksiyonun, ters transkripsiyon-nicel PCR (RT-qPCR) ve RNA dizilimi (RNAseq) gibi aşağı akış analizi için gerekli olan yeterli miktarda ve saflıkta RNA elde etmek için yeterli miktarda ve saflıkta bir şekilde alt bölümlere ayırma yöntemini detaylandırmamaktadır. Ayrıca, akış sitometrisine veya tamamen farklılaştırılmış ovidüktal hücrelerin tek hücreli RNAseq analizine uygun çoğunlukla enzimatik olmayan bir doku ayrışma yöntemidir. Açıklanan yöntemler, üreme, doğurganlık, kanser ve immünoloji alanında murine yumurta kanalını kullanarak daha fazla araştırmayı kolaylaştıracaktır.
Murin oviduct fonksiyon ve morfoloji olarak insan fallop tüpüne benzer1. Her ikisi de tarihsel olarak tanımlanmış iki epitel yerleşik hücreden oluşan sözde siliated epitelden oluşur: siliated hücreler ve salgı hücreleri1,2. Yumurta kanalının klasik olarak tanınan üç bölümü vardır: infundibulum, ampulla ve isthmus. Yeni bir çalışmada, Harwalkar ve ark. 3, yerleşik epitel hücrelerinin kategorizasyonunun yedi farklı popülasyona genişlemesine yol açan yumurta kanalı morfolojisi ve gen ekspresyasyonu araştırılmıştır. Buna ek olarak, ampullary-isthmus kavşağını oviduct3’ün ayrı bir segmenti olarak kurdular. Burada açıklanan ve infundibulum, ampulla ve isthmus’a odaklanan yöntem, ampullery-isthmic kavşağını da içerecek şekilde kolayca genişletilebilir2,3. İnfundibular bölge ostium veya yumurta kanalının açılmasını içerir ve fimbrial bölgenin yanı sıra proksimal sapı içerir. Rahime doğru ilerlerken, sırada ampulla ve sonra isthmus var. Siliated hücreler en çok bölgenin distal ucunda, yumurtalık proksimal veya infundibulumda öne çıkarken, salgı hücreleri en çok proksimal uçta veya isthmus segmentinde belirgindir1. İnsan fallop tüpünün aksine, murine oviduct, geniş ligament peritonunun bir uzantısı olan mezosalpinx tarafından desteklenen sarmal bir yapıdır1,4. Ek olarak, fare oviduct, oviduct4’e oosit transferi olasılığını artıran bir bursal keseye kaplanmıştır. Ampulla, gelişmekte olan embriyoların uterusa girmeden önce isthmusa geçtiği döllenme yeri olarak tanımlanır5. Tubal segmentler 200-400 μm çapında ve daha uzun ampullery ve isthmus bölgeleri yaklaşık 0.5-1.0 cm uzunluğundadır4. Östrous döngüsü sırasındaki oviduct distendleri ve ampulla ve infundibulum isthmus1’den daha dağılabilir.
Hücrelerin, özellikle de salgı hücrelerinin aşırı çoğalması, pelvik boşlukta bulunan seröz tümörlere öncü lezyonları karakterize eder6. Bu öncül seröz intraepithelial lezyonlar sadece fimbrial bölgede yumurta kanalı epitelinde ortaya çıkar; lezyon oluşumunun neden salgı 2,7,8 değil, normalde baskın hücre tipinin siliated olduğu bu bölge ile sınırlı olduğu bilinmemektedir. Normal fizyolojik fonksiyon açısından bölgesellik ve yumurtalık kanserinin ovidüktal kökenine olan ilginin artması9,10,11,12,13, yumurta kanalı segmentlerinin ayrı ayrı değerlendirilmesinin öneminin altını çizmektedir.
Burada açıklanan yöntem, segmente özgü gen ekspresyonunun ve ayrışmış hücrelerin işlevinin sonraki aşağı akış analizleri için ayrı ovidüktal segmentlerin toplanmasını detaylandırmaktadır. Geleneksel olarak, birçok doku fenolden sonra tüm RNA ekstraksiyonu için işlenir: kloroform yöntemi veya sütun üzerinde tam ekstraksiyon yöntemi; ancak açıklanan kombinasyon yöntemi ile yeterli verim üretilirken RNA kalitesinin korunduğunu tespit ettik. Bu yöntem kullanılarak, yumurta kanalının çok küçük fonksiyonel segmentleri, yumurta kanalını bir bütün olarak araştırmak yerine aşağı akış analizleri için işlenebilir ve bu da farklı segmentlerin sonuç temsilcisini maskeleyebilir14.
Dissositasyonlu murin ovidüktal hücreler, büyük olasılıkla bu dokudan hücre verimini sınırlaması nedeniyle akış sitometrisi tarafından nadiren araştırılmıştır. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir yaklaşım, hücreleri ayrıştırmak, kültürde büyütmek ve daha sonra aşağı akış hücre analizi için uygun hücre numaralarını elde etmek için yeniden farklılaşma in vitrosunu teşvik etmek olmuştur15,16,17,18. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, kültürde ex vivo ve değiştirilmiş mikroçevrim zamanıdır ve her ikisi de gen ekspresyonunun değişmesidir. Morfolojik yeniden farklılaşmanın, bozulmamış hayvanda mevcut olan transkripsiyon ve proteomik imzaya sahip olduğu varsayımı da vardır. Mevcut ayrışma yöntemi, tek hücre farklılaşması sürdürülürken heterojen ovidüktal hücre popülasyonunda en yüksek sayıda epitel hücre elde etmek için tasarlanmıştır. Ayrıca, çoğunlukla enzmatik olmayan yaklaşım muhtemelen hücre yüzey proteinlerinin kaybını sınırlar.
Yumurta kanalının üç segmenti histolojik, morfolojik ve fonksiyonel olarak farklı1,2,3’tür. Epitel, yumurta kanalının bir ucundan diğerine büyük ölçüde değişir. Fimbrial/infundibular uçta siliated hücreler baskınken, istik bölgede salgı hücreleri hakimdir1. Bu genel gradyan bir süredir tanınsa da, son çalışmalar oviductal segmentler arasında daha fazla ayrım ortaya çıkardı….
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen AMW’ye DoD Breakthrough Ödülü (BCRP W81XWH-14-1-0425) tarafından desteklendi. KCR kısmen intramural burslarla desteklendi: Pease Cancer Doktora Öncesi Bursu ve Mary Galvin Burden Biyomedikal Bilimler ve Kaliforniya Üniversitesi, Riverside’daki Doktora Öncesi Bursu, intramural ödüller: Lisansüstü Konsey Burs Komitesi Tez Araştırma Hibesi ve Lisansüstü Bölüm Tez Yılı Program Ödülü. Yazarlar Gillian M. Wright ve Alyssa M. Kumari’ye bu yöntemin erken sorun giderilmesinde yardımları için teşekkür eder.
0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
25G needle | BD | 305122 | |
60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20C for dissection |
Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text. |
Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |