التحضير البيولوجي والتقنية الميكانيكية لتحديد الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية
Summary
يصف البروتوكول طريقة لدراسة مرونة لزوجة المصفوفة خارج الخلية واعتمادها على تكوين البروتين أو العوامل البيئية. نظام المصفوفة المستهدف هو منطقة الماوس. يتم إثبات أداء هذه الطريقة من خلال مقارنة السلوك اللزج المرن للألياف المناطقية من النوع البري مع تلك التي تفتقر إلى البروتين السكري المرتبط بالألياف الدقيقة -1.
Abstract
المرونة ضرورية لوظيفة الأنسجة مثل الأوعية الدموية والعضلات والرئتين. هذه الخاصية مشتقة في الغالب من المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وهي شبكة البروتين التي تربط الخلايا والأنسجة معا. كيف ترتبط الخصائص المرنة لشبكة ECM بتكوينها ، وما إذا كانت خصائص الاسترخاء في ECM تلعب دورا فسيولوجيا ، هي أسئلة لم تتم معالجتها بالكامل بعد. يكمن جزء من التحدي في البنية المعقدة لمعظم أنظمة إدارة المحتوى المؤسسي وصعوبة عزل مكونات إدارة المحتوى المؤسسي دون المساس بهيكلها. أحد الاستثناءات هو zonule ، وهو نظام ECM موجود في عين الفقاريات. تتكون المنطقة من ألياف طولها مئات إلى آلاف الميكرومترات التي تمتد عبر المساحة الخالية من الخلايا بين العدسة وجدار العين. في هذا التقرير ، نصف تقنية ميكانيكية تستفيد من البنية عالية التنظيم للمنطقة لتحديد خصائصها المرنة اللزجة وتحديد مساهمة مكونات البروتين الفردية. تتضمن هذه الطريقة تشريح عين ثابتة لفضح العدسة والمنطقة وتستخدم تقنية السحب التي تمتد الألياف المناطقية بالتساوي أثناء مراقبة توترها. هذه التقنية غير مكلفة نسبيا ولكنها حساسة بما يكفي للكشف عن التغيرات في الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية في الفئران التي تفتقر إلى بروتينات إقليمية محددة أو مع الشيخوخة. على الرغم من أن الطريقة المعروضة هنا مصممة في المقام الأول لدراسة تطور العين ومرضها ، إلا أنها يمكن أن تكون أيضا نموذجا تجريبيا لاستكشاف أسئلة أوسع نطاقا تتعلق بالخصائص اللزجة المرنة ل ECM المرنة ودور العوامل الخارجية مثل التركيز الأيوني ودرجة الحرارة والتفاعلات مع جزيئات الإشارة.
Introduction
تحتوي عين الفقاريات على عدسة بصرية حية تساعد على تركيز الصور على شبكية العين1. يتم تعليق العدسة على المحور البصري بواسطة نظام من الألياف الدقيقة ذات التوجه الشعاعي ، كما هو موضح في الشكل 1A. في أحد الطرفين ، ترتبط الألياف بخط الاستواء للعدسة ، وفي الطرف الآخر ، بسطح الجسم الهدبي. تمتد أطوالها لمسافات تتراوح من 150 ميكرومتر في الفئران إلى 1 مم في البشر. بشكل جماعي ، تعرف هذه الألياف باسم zonule of Zinn2 ، أو المنطقة الهدبية ، أو ببساطة zonule. يمكن أن تؤثر صدمة العين والمرض وبعض الاضطرابات الوراثية على سلامة الألياف المناطقية3، مما يؤدي إلى فشلها في نهاية المطاف وما يصاحبها من فقدان للرؤية. في الفئران ، تحتوي الألياف على نواة تتكون في الغالب من بروتين الفيبريلين -2 ، وتحيط بها عباءة غنية بالفيبريلين-14. على الرغم من أن الألياف المناطقية فريدة من نوعها للعين ، إلا أنها تحمل العديد من أوجه التشابه مع ألياف ECM القائمة على الإيلاستين الموجودة في أماكن أخرى من الجسم. هذه الأخيرة مغطاة بعباءة فيبريلين-15 ولها أبعاد مماثلة للألياف المناطقية6. تم العثور على بروتينات أخرى ، مثل البروتينات المرتبطة بعامل النمو الكامن β (LTBPs) والبروتين السكري المرتبط بالألياف الدقيقة -1 (MAGP-1) ، بالاقتران مع كلا النوعين من الألياف 7،8،9،10،11. يتراوح معامل المرونة للألياف المناطقية بين 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16 ، مقارنة بالألياف القائمة على الإيلاستين (0.3-1.2 ميجا باسكال)17. تقودنا أوجه التشابه المعمارية والميكانيكية هذه إلى الاعتقاد بأن أي نظرة ثاقبة لأدوار البروتينات المرتبطة بالمناطق قد تساعد في توضيح أدوارها في الألياف المرنة الأخرى ECM.
الغرض الرئيسي من تطوير الطريقة الموصوفة هنا هو اكتساب نظرة ثاقبة حول دور بروتينات منطقة محددة في تطور أمراض العين الموروثة. النهج العام هو مقارنة الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية في الفئران من النوع البري مع تلك الخاصة بالفئران التي تحمل طفرات مستهدفة في الجينات التي تشفر البروتينات المناطقية. في حين تم استخدام العديد من الطرق سابقا لقياس الخصائص الميكانيكية المطاطية للألياف المناطقية ، فقد تم تصميمها جميعا لعيون الحيوانات الأكبر بكثير12،13،14،15،16. على هذا النحو النماذج ليست قابلة للجر وراثيا. سعينا إلى تطوير طريقة تجريبية أكثر ملاءمة للعيون الصغيرة والحساسة للفئران.
الطريقة التي طورناها لتقييم المرونة اللزجة للألياف المناطقية للفئران هي تقنية نشير إليها باسم فحص السحب 4,18 ، والذي يتم تلخيصه بصريا في الشكل 1. ويرد أدناه وصف مفصل لطريقة السحب وتحليل النتائج. نبدأ بوصف بناء الجهاز ، بما في ذلك الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد (3D) المستخدمة في المشروع. بعد ذلك ، نقوم بتفصيل البروتوكول المستخدم للحصول على العيون وإعدادها للتجربة. أخيرا ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية الحصول على بيانات لتحديد الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية. في قسم النتائج التمثيلية ، نشارك البيانات غير المنشورة سابقا التي تم الحصول عليها بطريقتنا حول الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية من الفئران التي تفتقر إلى MAGP-119 بالإضافة إلى مجموعة التحكم التي تم الحصول عليها من الحيوانات البرية المتطابقة مع العمر. وأخيرا ، نختتم بملاحظات عامة حول مزايا وقيود الطريقة ، واقتراحات للتجارب المحتملة التي قد توضح كيف تؤثر العوامل البيئية والكيميائية الحيوية على الخصائص اللزجة المرنة لألياف ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
ال zonule هو نظام ECM غير عادي حيث يتم ترتيب الألياف بشكل متماثل ويمكن التلاعب بها بشكل متطابق عن طريق إزاحة عدسة العين على طول المحور البصري. يمكن أيضا الوصول إلى الفضاء بسهولة دون انقطاع خلوي ، مما يسمح بدراسة الألياف في بيئة قريبة من حالتها الأصلية. تستفيد تقنية السحب من عرض ECM هذا للتعامل مع …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01 EY029130 (S.B.) و P30 EY002687 (S.B.) ، R01 HL53325 ومؤسسة Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.) ، ومؤسسة Marfan ، ومنحة غير مقيدة لقسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن من البحث لمنع العمى. كما حصل ج. ر. على منحة من جامعة العلوم الصحية والصيدلة لدعم هذا المشروع.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
Referências
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn’s zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
- Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
