O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.
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Artigo de método
Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento precoce depende de um conjunto de fatores maternos incorporados ao ovócito maduro durante a oogênese que desempenham todas as funções celulares necessárias para o desenvolvimento até a ativação do genoma zigótico. Normalmente, o direcionamento genético desses fatores maternos requer uma geração adicional para identificar fenótipos de efeito materno, dificultando a capacidade de determinar o papel dos genes expressos maternalmente durante o desenvolvimento. A descoberta das capacidades de edição bialélica da CRISPR-Cas9 permitiu a triagem de fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados ou "crispants", aumentando a compreensão do papel que os genes zigoticamente expressos desempenham nos programas de desenvolvimento. Este artigo descreve um protocolo que é uma extensão do método crispant. Neste método, a edição bialélica de células germinativas permite o isolamento de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, ou "crispants maternos". A multiplexação de RNAs guia para um único alvo promove a produção eficiente de crispants maternos, enquanto a análise de sequência de haploides crispantes maternos fornece um método simples para corroborar lesões genéticas que produzem um fenótipo de efeito materno. O uso de crispants maternos suporta a rápida identificação de genes maternos essenciais expressos, facilitando assim a compreensão do desenvolvimento precoce.
Introdução
Um conjunto de produtos depositados maternalmente (por exemplo, RNAs, proteínas e outras biomoléculas) é necessário para todos os processos celulares iniciais até que o genoma zigótico do embrião seja ativado1. O esgotamento prematuro desses produtos do ovócito é tipicamente letal embrionário. Apesar da importância desses genes no desenvolvimento, o papel de muitos genes expressos maternalmente é atualmente desconhecido. O avanço da tecnologia de edição de genes em peixes-zebra, como o CRISPR-Cas9, possibilita o direcionamento de genes expressos maternalmente 2,3,4
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Protocolo
Nos estudos que levaram ao desenvolvimento deste protocolo, todos os alojamentos e experimentos de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).
1. Síntese de RNAs Guia
NOTA: Os crispants zigóticos foram criados usando um único RNA guia ou multiplexando múltiplos RNAs guia para um único alvo 5,6,7,8,9,10. A mul....
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Resultados
A abordagem experimental descrita neste protocolo permite a identificação de fenótipos de efeito materno de forma rápida e eficiente em termos de recursos (Figura 1).
Gerando crispants maternos:
Ao projetar os quatro RNAs guia para atingir um único gene de efeito materno candidato, deve-se considerar especialmente onde os RNAs guia se ligarão ao DNA. Em geral, todos eles devem ser agrupados com regiões mínimas ou nenhuma sobreposição entre os R.......
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Discussão
O protocolo apresentado neste manuscrito permite a identificação e caracterização molecular primária de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, em vez das múltiplas gerações necessárias para técnicas genéticas avançadas e reversas. Atualmente, o papel de muitos genes expressos maternalmente é desconhecido. Essa falta de conhecimento se deve, em parte, à geração extra necessária para visualizar um fenótipo ao identificar genes de efeito materno. No passado, a rápida identificação de genes de efeito materno em .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos antigos e atuais membros da equipe de criação de animais de laboratório da Pelegri por seu cuidado com a instalação aquática. Também somos gratos pelos comentários e insights sobre o manuscrito de Ryan Trevena e Diane Hanson. O financiamento foi fornecido pela subvenção do NIH à F.P. (GM065303)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 8,4) | Invirogen | 15568025 | Para mistura de PCR |
| 1,5 mL Eppendorf Tubes | Qualquer fabricante | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Síntese de gRNA |
| 100 BP ladder | Qualquer fabricante | Para eletroforese em gel | |
| 100% etanol livre de RNAse | Qualquer fabricante | ||
| 100% RNAse etanol grátis | Qualquer fabricante | ||
| 100ml Béquer | Qualquer fabricante | para FIV | |
| 5 M Acetato de amônio | Thermo Fischer Científico | Encontrado no MEGAshortscript T7 Kit de Transcrição | Síntese de gRNA |
| 70% Etanol | Síntese de gRNA (70 mL de etanol + 30 mL de água livre de nuclease) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | para Microinjeção |
| a Granel Pharma Bicarbonato de Sódio 35 libras Fornecimento de | Recife a Granel | 255 | Suprimentos |
| de Peixe CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Proteína com NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Oligonucleotídeo constante | DNA integrado Tecnologias (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC | |
| Placa de vidro para depressão | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | fertilização in vitro |
| Dumont | SS | de fertilização in vitro | |
| Ferramentas de ciências finas | 14091-09 | para fertilização | |
| in vitroEstereoscópio de dissecação (com fonte de luz transmitida) | Qualquer fabricante | para DNA de fertilização in vitro | |
| limpo e Pesquisa | D4014 | Zymo | do gRNA |
| (6x) | Any Maker | para a eletroforese | |
| Polimerase Lucigen | 30032-1 | ADN de EconoTaq | para a fonte |
| de alimentação da eletroférese | Todo o fabricante | para o | |
| conjunto | do gel https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Pontas de Microcarregador Femtotips para Microinjetor Femtojet | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | para Microinjeção |
| de Etanol (200 provas, sem nuclease) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | para Microinjeção |
| Rede de Pesca | Qualquer Maker | Fish fornece | |
| Camarão de Salmoura Congelado | Camarão de Salmoura Direto | Suprimentos de peixe | |
| Geral Agarose multiuso | Qualquer fabricante | Para eletroforese | |
| em gel Oligonucleotídeo específico do gene Tecnologias | integradas de DNA (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Luvas | Qualquer fabricante | ||
| Balde de gelo | Qualquer fabricante | ||
| Sal oceânico instantâneo | Qualquer fabricante | Suprimentos para peixes | |
| Brometo de Etídio UltraPure Invitrogen, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Masculino & Kit de | |||
| MEGAshortscript | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Síntese de gRNA |
| Azul de Metileno | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | Para E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | Para PCR mix |
| MgSO2· 7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Molde de plástico de microinjeção | World Precision Instruments | Z-Molds | para microinjeção |
| Micromanipulador | Qualquer fabricante | para micropipeters de microinjeção | |
| Qualquer fabricante | |||
| Extrator de micropipeta | Sutter | P-87 | para microinjeção |
| Pontas de micropipetter com filtros (todos os tamanhos) | Qualquer fabricante | ||
| Pontas de micropipetter sem filtros (todos os tamanhos) | Microondas de qualquer fabricante | ||
| fabricante | |||
| Óleo mineral | MiliporeSigma | m5904-5ml | para microinjeção |
| MS-222 (Tricaine-D) | Qualquer fabricante | aprovado pela FDA | |
| Na2 HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Tubos de Microfuga Antiaderentes, sem RNase, 1,5 mL | Ambion | AM12450 | Síntese de água livre de gRNA |
| nuclease | Qualquer fabricante | ||
| papel | Qualquer fabricante | ||
| Pipetas Pastro | Qualquer fabricante | ||
| Tubos de tiras de PCR | Qualquer fabricante | ||
| Placas de Petri de 100 mm de diâmetro | Qualquer fabricante | ||
| Solução de vermelho de fenol | MiliporeSigma | P0290 | para microinjeção |
| de pedais de plástico | VWR | 47747-358 | de fertilização in vitro |
| Qualquer fabricante | para fertilização in vitro | ||
| Ovos de artêmia de grau premium | Camarão de salmoura | ||
| encontrado no kit de transcrição MEGAshortscript T7 | para eletroforese em gel | ||
| 21-402-178 | |||
| Escala | Qualquer Fabricante | ||
| Sharpie | Qualquer Fabricante | ||
| Espátula | Qualquer Fabricante | ||
| Estéril H2O | Qualquer Fabricante | Para PCR mix | |
| T4 DNA Polimerase | NEB | M0203 | Síntese de fita de gRNA |
| Qualquer Fabricante | |||
| TBE (Tris-Borato-EDTA) 10x | Qualquer Fabricante | Para eletroforese em gel | |
| Chá Stainer | Amazon | IMU-71133W | Suprimentos |
| para peixesPente Thermo Scientific Owl 12-Tooth, 1.0/1.5 mm Thick, Dupla Face para B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | Para eletroforese em gel |
| Thermo Scientific Coruja EasyCast B2 Mini Sistemas de Eletroforese em Gel | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | Para eletroforese em gel |
| Termociclador | Qualquer fabricante | ||
| Termociclador | Qualquer fabricante | ||
| Transiluminador | Qualquer fabricante | ||
| Lâmpada UV | UVP | Modelo XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | de fertilização in vitro |
| Qualquer fabricante | de fertilização in vitro | ||
| Thermo Fischer Scientific | S39015 | Suprimentos para peixes | |
| Caixas de acasalamento de peixe-zebra | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Suprimentos para peixes |
| 1,5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 molares dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP escada | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% de etanol livre de RNAse | qualquer fabricante | ||
| 5m Acetato de amônio | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Etanol | 70ml de etanol e 30 ml de água livre de nuclease | ||
| Acessórios para caixa de gel horizontal | Fisher Scientific | 0,625 mm | |
| Agarose | qualquer fabricante | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, di-hidratado | Sigma | 10035-04-8 | E3 Tubo |
| Capilar | Cole-Parmer | UX-03010-68 | para agulhas de injeção |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computador | qualquer fabricante | ||
| Dissecando Forceptos | qualquer fabricante | ||
| Microscópio de dissecação | qualquer fabricante | ||
| Tesoura de dissecação | qualquer fabricante | ||
| DNA Limpo e Concentrador -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polimerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetaTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microlitros |
| Etanol (200 provas, livre de nuclease) | qualquer fabricante | ||
| Brometo de Etídio | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Rede de Pesca | qualquer fabricante | malha fina | |
| Camarão em Salmoura Congelado | LiveAquaria | CD-12018 | comida para peixes |
| Gel Comb (0,625 mm) | qualquer fabricante | ||
| Sistema de Eletroférese em Gel | qualquer fabricante | ||
| Tecnologias integradas de DNA de oligonucleotídeo específico de gene | (IDT) | ||
| Agulha capilar de vidro | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds |
| Pratos de vidro | qualquer fabricante | ||
| Luvas | qualquer fabricante | ||
| Solução de Trabalho | Combine 9,9 ml de Hank's Premix com 0,1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine o seguinte em ordem: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Armazene todos os HS Solotions em 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | |||
| https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization Hank's Stock Solution #1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl em 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0,358 g de Na2HPO4 anidro; 0,60 g K2H2PO4 em 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0,72 g CaCl2 em 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1,23 g MgSO47H2O em 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0,35g NaHCO3 em 10,0 ml ddH20; faça fresco dia de uso | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Balde de Gelo | qualquer fabricante | ||
| Sal oceânico instantâneo | qualquer fabricante | para água de peixe | |
| Kit de Transcrição In Vitro Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ Água Destilada Sem DNase/RNase | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Médio |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Kit de Tradução | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| azul de metileno | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Médio |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulador | |||
| Microinjeção molde de plástico | Instrumentos de Precisão Mundial | Moldes | |
| Z Microinjetor | |||
| Microagulha Slide | |||
| Micropipeter (1-10) com pontas | qualquer fabricante | precisa de pontas p10 filtradas | |
| Micropipetter (20-200) com pontas | qualquer fabricante | ||
| Micropippetter (100-1000) com pontas | qualquer fabricante | ||
| Microplastic slide | |||
| Microondas | qualquer fabricante | ||
| MiliQ Water | any fabricante | ||
| de óleo mineral | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma S9888 | ||
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Espátula estreita | qualquer fabricante | ||
| Extrator de Agulhas | Sutter | P-97 | |
| Toalha de Papel | qualquer fabricante | ||
| Pipetas Pastro Fisher | Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanqueando guia RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Padrão dessalinizado | |
| Tubos de tira PCR | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm de diâmetro 100mm x 15mm |
| Fenol vermelho | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| pontas de pipeta | qualquer fabricante | 10ul, 200ul e 1000ul pontas | |
| Pestais de Plástico | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Colher de Plástico | qualquer fabricante | ||
| Guia de Primer Site | Tecnologias Integradas de DNA (IDT) | ||
| Lâmina de Barbear | Uline | H-595B | |
| RNA gel Carregando Corante | em kit de script megashort(kit de transcipção in vitro) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| Tubos de microcentrífuga de polipropileno livre de RNAse | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| água livre de RNAse | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Escala | qualquer fabricante | ||
| Sharpie | qualquer fabricante | ||
| Bicarbonato de sódio (célula cultura testada) | Sigma | S5761 | água de peixe |
| Brometo de Sódio Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software para sequenciamento de sanger Análise | |||
| Espectrofotômetro | |||
| Sterlie H2O | qualquer marca | ||
| T4 DNA Polimerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Fita | de qualquer marca | ||
| TBE (Tris-Borato-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 Manchador de Chá | amazon | IMU-71133W | disponível na maioria das lojas de cozinha |
| Termociclador | |||
| Pipeta de transferência | Uline | S-24320 | |
| Transiluminador | |||
| Tricaine | Fisher Scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC | |
| Lâmpada UV | UVP | ||
| Óculos de segurança UV | qualquer fabricante | ||
| Garrafa de lavagem | fisher scientific | S39015 | |
| Caixas de acasalamento de peixe-zebra | qualquer fabricante | ||
| Receita | de buffer de PCRAdicione 171,12mL de H20 estéril; 0,393 mL 1M MgCl2; 2,616mL 1M MgCl2; 2,618 mL 1M Tris-HCl (pH 8,4) 13,092mL 1M KCl; 0,262 mL de gelatina a 1%. Autoclave por 20 minutos e depois resfrie o solo no gelo. Em seguida, adicione 3.468 mL 100mg / mL BSA; 0,262 mL dATP (100mM), 0,262mL dCTP (100mM); 0,262 mL dGTP (100mM); 0,262 mL dTTP (100mL). Alliquote em tubos |
Referências
- Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body....
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Reimpressões e permissões
