Kip recombinante ledematen test om morfogenese, patroonvorming en vroege stappen in celdifferentiatie te begrijpen
Summary
Recombinante ledematen zijn een krachtig experimenteel model dat het mogelijk maakt om het proces van celdifferentiatie en het genereren van patronen onder invloed van embryonale signalen te bestuderen. Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van recombinante ledematen met kippen ledemaat-mesodermale cellen, aanpasbaar aan andere celtypen verkregen uit verschillende organismen.
Abstract
Celdifferentiatie is het verfijnde proces van celverbintenis dat leidt tot de vorming van verschillende gespecialiseerde celtypen tijdens de oprichting van zich ontwikkelende weefsels en organen. Dit proces wordt actief in stand gehouden op volwassen leeftijd. Celdifferentiatie is een continu proces tijdens de ontwikkeling en homeostase van organen. Het begrijpen van de vroege stappen van celdifferentiatie is essentieel om andere complexe processen zoals morfogenese te kennen. Recombinante kippenledematen zijn dus een experimenteel model dat de studie van celdifferentiatie en patroongeneratie onder embryonale patroonsignalen mogelijk maakt. Dit experimentele model imiteert een in vivo omgeving; het assembleert gereaggregateerde cellen tot een ectodermale bedekking verkregen uit een vroege ledemaatknop. Later worden ectodermen overgebracht en geïmplanteerd in een kuikenembryoreceptor om de ontwikkeling ervan mogelijk te maken. Deze test werd voornamelijk gebruikt om mesodermale ledemaatknopcellen te evalueren; het kan echter worden toegepast op andere stam- of voorlopercellen van andere organismen.
Introduction
De gewervelde ledemaat is een formidabel model voor het bestuderen van celdifferentiatie, celproliferatie, celdood, patroonvorming en morfogenese 1,2. Tijdens de ontwikkeling komen ledematen tevoorschijn als uitstulpingen van de cellen die zijn afgeleid van lateraal plaat mesoderm1. Ledemaatknoppen bestaan uit een centrale kern van mesodermale cellen bedekt met een ectoderm. Uit deze vroege structuur komt een geheel en goed gevormd ledemaat tevoorschijn. Nadat de ledemaatknop ontstaat, worden drie assen herkend: (1) de proximo-distale as ([PD] schouder tot vingers), (2) de dorso-ventrale as ([DV] van de rug van de hand naar de handpalm) en (3) de voorste-achterste ([AP] duim naar vinger). De proximaal-distale as hangt af van de apicale ectodermale richel (AER), gespecialiseerd ectoderm aan de distale punt van de ledemaatknop. De AER is nodig voor uitgroei, overlevingsonderhoud, proliferatie en de ongedifferentieerde toestand van cellen die signalen ontvangen 2,3. Aan de andere kant regelt de zone van polariserende activiteit (ZPA) anteroposteriorpatroon4, terwijl het dorsale en ectoderm dorsoventrale patronen 7,8 regelen. Integratie van driedimensionale patronen impliceert complexe overspraak tussen deze drie assen5. Ondanks het begrijpen van de moleculaire route tijdens de ontwikkeling van ledematen, blijven open vragen over de mechanismen die patronen en de juiste uitgroei regelen om een hele ledemaat te vormen onbeantwoord.
Edgar Zwilling ontwikkelde het recombinante ledemaat (RL) systeem in 1964 om de interacties tussen mesenchymale cellen van ledematen en het ectoderm bij het ontwikkelen van ledematen te bestuderen6. Het RL-systeem assembleert het gedissocieerde-gereaggregateerde mesoderm van de ledemaatknop in het embryonale ledemaat-ectoderm om het te transplanteren in het dorsale deel van een donorkuikenembryo. De signalen van het ectoderm induceren de expressie van differentiatiegenen en patroongenen op een spatio-temporele manier, waardoor de vorming van een ledemaatachtige structuur wordt geïnduceerd die de celprogramma’s kan samenvatten die optreden tijdens de ontwikkeling van ledematen 7,8,9.
Het RL-model is waardevol voor het begrijpen van de eigenschappen van ledemaatcomponenten en de interactie tussen mesodermale en ectodermale cellen6. Een RL kan worden gedefinieerd als een ledemaatachtige structuur die wordt gecreëerd door de experimenteel assemblerende of recombinerende mesodermale cellen van ledemaatknopen in een ectodermale dekking6. De morfogenese van de RL hangt af van de kenmerken van de mesodermale cellen (of andere typen) die zullen reageren op de ectodermale patroonsignalen. Een van de voordelen van dit experimentele systeem is de veelzijdigheid. Deze eigenschap maakt het mogelijk om meerdere combinaties te maken door de bron van mesodermale cellen, zoals cellen uit verschillende ontwikkelingsstadia, te variëren vanuit verschillende posities langs de ledemaat, of hele (niet-gesoctroeerde) of gereaggregateerde cellen 7,8,9,10. Een ander voorbeeld is het vermogen om het embryonale ectoderm te verkrijgen van andere soorten dan kip, bijvoorbeeld schildpad11, kwartel of muis12.
In die zin helpt de RL-techniek bij het bestuderen van de ontwikkeling van ledematen en de interacties tussen mesenchymale en ectodermale cellen van ledematen vanuit een evolutionair oogpunt. Deze techniek heeft ook een groot potentieel voor het analyseren van het vermogen van verschillende bronnen van voorlopercellen om te differentiëren in een ledemaatachtige structuur door gebruik te maken van de signalen van het embryonale ectoderm 12,13,14. In tegenstelling tot in vitro culturen maakt de RL het mogelijk om de differentiatie en het morfogenetische potentieel van een celpopulatie te evalueren door embryonale signalen van een zich ontwikkelende ledemaatte interpreteren 9,15.
In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gegeven voor het uitvoeren van succesvolle RL met gereaggregateerde mesodermale ledemaatknopcellen, waardoor de mogelijkheid wordt geopend om dit protocol aan te passen met verschillende bronnen van gereaggregateerde cellen of zelfs verschillende ectodermbronnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Over het algemeen kan het RL-protocol worden onderverdeeld in vijf stappen: (1) embryo-incubatie, (2) het verkrijgen van mesodermale cellen van ledematen om de ectodermen te vullen, (3) het verkrijgen van de ectodermen, (4) het assembleren van mesodermale cellen in de ectodermale dekens en (5) transplantatie van de gevulde ectodermen in de gastheerembryo’s. De belangrijkste beperking van de RL-techniek is het lange, gedetailleerde protocol, dat veel kritieke punten heeft die geduld vereisen om correct te presteren. Om he…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Estefania Garay-Pacheco voor de beelden in figuur 2 en Maria Valeria Chimal-Montes de Oca voor het artwork. Dit werk werd ondersteund door de Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [subsidienummers IN211117 en IN213314] en Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [subsidienummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] toegekend aan JC-M. JC M-L ontving een postdoctoraal mandaat van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
Referências
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Biologia do Desenvolvimento. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Biologia do Desenvolvimento. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Biologia do Desenvolvimento. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Biologia do Desenvolvimento. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
