Test des membres recombinants du poulet pour comprendre la morphogenèse, la modelation et les premières étapes de la différenciation cellulaire

Summary

Les membres recombinants sont un modèle expérimental puissant qui permet d’étudier le processus de différenciation cellulaire et la génération de motifs sous l’influence de signaux embryonnaires. Ce protocole présente une méthode détaillée pour générer des membres recombinants avec des cellules mésodermiques de membres de poulet, adaptables à d’autres types de cellules obtenues à partir de différents organismes.

Abstract

La différenciation cellulaire est le processus affiné de l’engagement cellulaire conduisant à la formation de différents types de cellules spécialisées lors de l’établissement de tissus et d’organes en développement. Ce processus est activement maintenu à l’âge adulte. La différenciation cellulaire est un processus continu au cours du développement et de l’homéostasie des organes. Comprendre les premières étapes de la différenciation cellulaire est essentiel pour connaître d’autres processus complexes tels que la morphogenèse. Ainsi, les membres de poulet recombinants sont un modèle expérimental qui permet d’étudier la différenciation cellulaire et la génération de motifs sous des signaux de motifs embryonnaires. Ce modèle expérimental imite un environnement in vivo ; il assemble des cellules réagrégées en une couverture ectodermique obtenue à partir d’un bourgeon de membre précoce. Plus tard, les ectodermes sont transférés et implantés dans un récepteur embryonnaire de poussin pour permettre son développement. Ce test a été principalement utilisé pour évaluer les cellules des bourgeons des membres mésodermiques; cependant, il peut être appliqué à d’autres cellules souches ou progénitrices d’autres organismes.

Introduction

Le membre vertébré est un formidable modèle pour étudier la différenciation cellulaire, la prolifération cellulaire, la mort cellulaire, la formation de motifs et la morphogenèse ^1,2. Au cours du développement, les membres émergent sous forme de renflements des cellules dérivées du mésoderme à plaque latérale¹. Les bourgeons des membres sont constitués d’un noyau central de cellules mésodermiques recouvertes d’un ectoderme. De cette structure précoce, un membre entier et bien formé émerge. Après l’apparition du bourgeon du membre, trois axes sont reconnus: (1) l’axe proximo-distal ([] épaule aux doigts), (2) l’axe dorso-ventral ([DV] de l’arrière de la main à la paume), et (3) l’avant-postérieur ([AP] pouce à doigt). L’axe proximal-distal dépend de la crête ectodermique apicale (AER), ectoderme spécialisé situé à l’extrémité distale du bourgeon du membre. L’AER est nécessaire pour l’excroissance, le maintien de la survie, la prolifération et l’état indifférencié des cellules recevant des signaux ^2,3. D’autre part, la zone d’activité polarisante (ZPA) contrôle le motif antéropostérieur⁴, tandis que le motif dorsal et ectoderme contrôle le motif dorsoventral ^7,8. L’intégration de motifs tridimensionnels implique une diaphonie complexe entre ces trois axes⁵. Malgré la compréhension de la voie moléculaire au cours du développement des membres, les questions ouvertes sur les mécanismes qui contrôlent la structure et l’excroissance appropriée pour former un membre entier restent sans réponse.

Edgar Zwilling a développé le système des membres recombinants (RL) en 1964 pour étudier les interactions entre les cellules mésenchymateuses des membres et l’ectoderme dans les membres en développement⁶. Le système RL assemble le mésoderme dissocié-réagrégé du bourgeon du membre dans l’ectoderme embryonnaire du membre pour le greffer dans la partie dorsale d’un embryon de poussin donneur. Les signaux fournis par l’ectoderme induisent l’expression de gènes de différenciation et de gènes de modelage de manière spatio-temporelle, induisant ainsi la formation d’une structure semblable à un membre qui peut récapituler les programmes cellulaires qui se produisent pendant le développement du membre ^7,8,9.

Le modèle RL est précieux pour comprendre les propriétés des composants des membres et l’interaction entre les cellules mésodermiques et ectodermiques⁶. Un RL peut être défini comme une structure semblable à un membre créée par l’assemblage ou la recombinaison expérimentale de cellules mésodermiques de bourgeons de membres à l’intérieur d’une couverture ectodermique⁶. La morphogenèse du RL dépend des caractéristiques des cellules mésodermiques (ou d’autres types) qui répondront aux signaux de modelage ectodermique. L’un des avantages de ce système expérimental est sa polyvalence. Cette caractéristique permet la création de multiples combinaisons en faisant varier la source des cellules mésodermiques, telles que des cellules de différents stades de développement, de différentes positions le long du membre, ou des cellules entières (non dissociées) ou réagrégées 7,8,9,10. Un autre exemple est la capacité d’obtenir l’ectoderme embryonnaire d’espèces autres que le poulet, par exemple, la tortue¹¹, la caille ou la souris¹².

En ce sens, la technique RL aide à étudier le développement des membres et les interactions entre les cellules mésenchymateuses et ectodermiques des membres d’un point de vue évolutif. Cette technique a également un grand potentiel pour analyser la capacité de différentes sources de cellules progénitrices à se différencier en une structure semblable à un membre en tirant parti des signaux fournis par l’ectoderme embryonnaire 12,13,14. Contrairement aux cultures in vitro, le RL permet d’évaluer la différenciation et le potentiel morphogénétique d’une population cellulaire en interprétant les signaux embryonnaires d’un membre en développement ^9,15.

Dans ce protocole, un guide étape par étape pour effectuer une RL réussie avec des cellules de bourgeons de membres mésodermiques réagrégés est fourni, ouvrant ainsi la possibilité d’adapter ce protocole avec différentes sources de cellules réagrégées ou même différentes sources d’ectodermes.

Protocol

Cette recherche a été examinée et approuvée par le Comité d’examen institutionnel pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico, Mexique). Un organigramme schématique des étapes générales de ce protocole est illustré à la figure 1A. 1. Incubation embryonnaire et détermination de la viabilité Incuber des œu…

Representative Results

Reconnaître un membre recombinant bien performantAprès la greffe, les embryons manipulés ont été renvoyés dans l’incubateur pour permettre au RL de se développer. Le temps d’incubation était en corrélation avec les exigences de l’expérience. Néanmoins, le RL peut être facilement distingué après 12 h d’implantation. Pour déterminer si l’implantation était adéquate, le LR a été observé comme une protubérance solidement fixée à la paroi mésodermique de l’embryon donne…

Discussion

En général, le protocole RL peut être divisé en cinq étapes: (1) l’incubation d’embryons, (2) l’obtention de cellules mésodermiques de membres pour remplir les ectodermes, (3) l’obtention des ectodermes, (4) l’assemblage de cellules mésodermiques à l’intérieur des couvertures ectodermiques, et (5) la transplantation des ectodermes remplis dans les embryons hôtes. La principale limite de la technique RL est le protocole long et détaillé, qui comporte de nombreux points critiques qui nécessitent de…

Materials

Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01