चिकन पुनः संयोजक अंग परख Morphogenesis, Patterning, और सेल भेदभाव में प्रारंभिक कदम को समझने के लिए
Summary
पुनः संयोजक अंग एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल है जो कोशिका भेदभाव की प्रक्रिया और भ्रूण संकेतों के प्रभाव में पैटर्न की पीढ़ी का अध्ययन करने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल चिकन अंग-मेसोडर्मल कोशिकाओं के साथ पुनः संयोजक अंगों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करता है, जो विभिन्न जीवों से प्राप्त अन्य सेल प्रकारों के अनुकूल है।
Abstract
सेल विभेदन कोशिका प्रतिबद्धता की ठीक-ठाक प्रक्रिया है जो विकासशील ऊतकों और अंगों की स्थापना के दौरान विभिन्न विशेष सेल प्रकारों के गठन के लिए अग्रणी है। यह प्रक्रिया वयस्कता में सक्रिय रूप से बनाए रखी जाती है। कोशिका विभेदन अंगों के विकास और होमियोस्टैसिस के दौरान एक सतत प्रक्रिया है। सेल भेदभाव के शुरुआती चरणों को समझना अन्य जटिल प्रक्रियाओं जैसे कि मॉर्फोजेनेसिस को जानने के लिए आवश्यक है। इस प्रकार, पुनः संयोजक चिकन अंग एक प्रयोगात्मक मॉडल है जो भ्रूण पैटर्निंग संकेतों के तहत सेल भेदभाव और पैटर्न पीढ़ी के अध्ययन की अनुमति देता है। यह प्रयोगात्मक मॉडल विवो वातावरण में एक की नकल करता है; यह एक प्रारंभिक अंग कली से प्राप्त एक एक्टोडर्मल कवर में reagreggated कोशिकाओं को इकट्ठा करता है। बाद में, एक्टोडर्म्स को स्थानांतरित कर दिया जाता है और इसके विकास की अनुमति देने के लिए एक चूजे के भ्रूण रिसेप्टर में प्रत्यारोपित किया जाता है। इस परख मुख्य रूप से mesodermal अंग कली कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; हालांकि, इसे अन्य जीवों से अन्य स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
कशेरुकी अंग कोशिका भेदभाव, सेल प्रसार, कोशिका मृत्यु, पैटर्न गठन, और मॉर्फोजेनेसिस 1,2 का अध्ययन करने के लिए एक दुर्जेय मॉडल है। विकास के दौरान, अंग पार्श्व प्लेट मेसोडर्म1 से व्युत्पन्न कोशिकाओं से उभार के रूप में उभरते हैं। अंग कलियों में एक एक्टोडर्म द्वारा कवर किए गए मेसोडर्मल कोशिकाओं का एक केंद्रीय कोर होता है। इस प्रारंभिक संरचना से, एक संपूर्ण और अच्छी तरह से गठित अंग उभरता है। अंग कली के उत्पन्न होने के बाद, तीन अक्षों को पहचाना जाता है: (1) प्रोक्सिमो-डिस्टल अक्ष ([पीडी] कंधे से उंगलियों तक), (2) डोरसो-वेंट्रल अक्ष ([डीवी] हाथ के पीछे से हथेली तक), और (3) पूर्वकाल-पश्चवर्ती ([एपी] अंगूठे से उंगली तक)। समीपस्थ-डिस्टल अक्ष एपिकल एक्टोडर्मल रिज (एईआर) पर निर्भर करता है, जो अंग कली के डिस्टल टिप पर स्थित विशेष एक्टोडर्म है। एईआर को आउटग्रोथ, उत्तरजीविता रखरखाव, प्रसार, औरसिग्नल प्राप्त करने वाली कोशिकाओं की अविभाजित स्थिति 2,3 के लिए आवश्यक है। दूसरी ओर, ध्रुवीकरण गतिविधि (ZPA) का क्षेत्र एंटेरोपोस्टीरियर पैटर्निंग4 को नियंत्रित करता है, जबकि पृष्ठीय और एक्टोडर्म डोर्सोवेंट्रल पैटर्निंग 7,8 को नियंत्रित करता है। त्रि-आयामी पैटर्निंग के एकीकरण का तात्पर्य इन तीन अक्षों के बीच जटिल क्रॉसस्टॉक5 है। अंग विकास के दौरान आणविक मार्ग को समझने के बावजूद, तंत्र के बारे में खुले प्रश्न जो पैटर्निंग को नियंत्रित करते हैं और एक पूरे अंग को बनाने के लिए उचित आउटग्रोथ अनुत्तरित रहते हैं।
एडगर ज़विलिंग ने 1964 में पुनः संयोजक अंग (आरएल) प्रणाली विकसित की ताकि अंग मेसेनकाइमल कोशिकाओं और विकासशील अंगों में एक्टोडर्म के बीच बातचीत का अध्ययनकिया जा सके। आरएल प्रणाली इसे एक दाता चूजे के भ्रूण के पृष्ठीय भाग में ग्राफ्ट करने के लिए भ्रूण अंग एक्टोडर्म में विघटित-reaggregated अंग कली मेसोडर्म को इकट्ठा करती है। एक्टोडर्म द्वारा प्रदान किए गए संकेत भेदभाव जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं और एक स्पैटिओ-टेम्पोरल तरीके से जीन को पैटर्न करते हैं, इस प्रकार एक अंग जैसी संरचना के गठन को प्रेरित करते हैं जो अंग विकास 7,8,9 के दौरान होने वाले सेल कार्यक्रमों को दोहरा सकते हैं।
आरएल मॉडल अंग घटकों के गुणों और मेसोडर्मल और एक्टोडर्मल कोशिकाओं के बीच बातचीतको समझने के लिए मूल्यवान है। एक आरएल को एक एक्टोडर्मल कवर 6 के अंदर प्रयोगात्मक रूप से इकट्ठा करने या फिर से संयोजित अंग कली मेसोडर्मल कोशिकाओं द्वारा बनाई गई अंग जैसी संरचना के रूप में परिभाषित किया जा सकताहै। आरएल का मॉर्फोजेनेसिस मेसोडर्मल कोशिकाओं (या अन्य प्रकार) की विशेषताओं पर निर्भर करता है जो एक्टोडर्मल पैटर्निंग संकेतों का जवाब देंगे। इस प्रयोगात्मक प्रणाली के फायदों में से एक इसकी बहुमुखी प्रतिभा है। यह विशेषता मेसोडर्मल कोशिकाओं के स्रोत को अलग-अलग करके कई संयोजनों के निर्माण की अनुमति देती है, जैसे कि विभिन्न विकास ता्मक चरणों से कोशिकाएं, अंग के साथ विभिन्न पदों से, या पूरे (अविच्छिन्न) या पुन: एकत्रित कोशिकाएं 7,8,9,10। एक अन्य उदाहरण चिकन के अलावा अन्य प्रजातियों से भ्रूण एक्टोडर्म प्राप्त करने की क्षमता है, उदाहरण के लिए, कछुए11, बटेर, या माउस12।
इस अर्थ में, आरएल तकनीक अंग विकास और विकासवादी दृष्टिकोण से अंग मेसेनकाइमल और एक्टोडर्मल कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने में मदद करती है। इस तकनीक में भ्रूण एक्टोडर्म12,13,14 द्वारा प्रदान किए गए संकेतों का लाभ उठाकर एक अंग जैसी संरचना में अंतर करने के लिए पूर्वज कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों की क्षमता का विश्लेषण करने की भी बड़ी क्षमता है। इन विट्रो संस्कृतियों के विपरीत, आरएल एक विकासशील अंग 9,15 से भ्रूण संकेतों की व्याख्या करके एक सेल आबादी के भेदभाव और मॉर्फोजेनेटिक क्षमता का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल में, reaggregated mesodermal अंग कली कोशिकाओं के साथ सफल आरएल प्रदर्शन करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान की जाती है, इस प्रकार इस प्रोटोकॉल को पुन: एकत्रित कोशिकाओं या यहां तक कि विभिन्न एक्टोडर्म स्रोतों के विभिन्न स्रोतों के साथ अनुकूलित करने की संभावना को खोलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सामान्य तौर पर, आरएल प्रोटोकॉल को पांच चरणों में विभाजित किया जा सकता है: (1) भ्रूण इनक्यूबेशन, (2) एक्टोडर्म्स को भरने के लिए अंग मेसोडर्मल कोशिकाओं को प्राप्त करना, (3) एक्टोडर्म्स प्राप्त करना, (4) एक्टोडर्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चित्रा 2 में छवियों के लिए Estefania Garay-Pacheco और कलाकृति के लिए मारिया Valeria Chimal-Montes de Oca के लिए धन्यवाद. इस काम Dirección जनरल डी Asuntos del व्यक्तिगत Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [अनुदान संख्या IN211117 और IN213314] और Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [अनुदान संख्या 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] द्वारा समर्थित किया गया था, जो जेसी-एम को सम्मानित किया गया था। जेसी एम-एल Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप के प्राप्तकर्ता थे।
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
Referências
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Biologia do Desenvolvimento. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Biologia do Desenvolvimento. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Biologia do Desenvolvimento. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Biologia do Desenvolvimento. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
