Test degli arti ricombinanti di pollo per comprendere la morfogenesi, i modelli e i primi passi nella differenziazione cellulare

Summary

Gli arti ricombinanti sono un potente modello sperimentale che consente di studiare il processo di differenziazione cellulare e la generazione di modelli sotto l’influenza di segnali embrionali. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per generare arti ricombinanti con cellule mesodermiche di pollo, adattabili ad altri tipi di cellule ottenute da organismi diversi.

Abstract

La differenziazione cellulare è il processo messo a punto dell’impegno cellulare che porta alla formazione di diversi tipi di cellule specializzate durante la creazione di tessuti e organi in via di sviluppo. Questo processo viene mantenuto attivamente in età adulta. La differenziazione cellulare è un processo continuo durante lo sviluppo e l’omeostasi degli organi. Comprendere le prime fasi della differenziazione cellulare è essenziale per conoscere altri processi complessi come la morfogenesi. Pertanto, gli arti di pollo ricombinanti sono un modello sperimentale che consente lo studio della differenziazione cellulare e della generazione di modelli sotto segnali di pattern embrionali. Questo modello sperimentale imita un ambiente in vivo ; assembla cellule riaggregate in una copertura ectodermica ottenuta da una gemma precoce dell’arto. Successivamente, gli ectodermi vengono trasferiti e impiantati in un recettore dell’embrione di pulcino per consentirne lo sviluppo. Questo test è stato utilizzato principalmente per valutare le cellule delle gemme mesodermiche degli arti; tuttavia, può essere applicato ad altre cellule staminali o progenitrici di altri organismi.

Introduction

L’arto vertebrato è un modello formidabile per studiare la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, la morte cellulare, la formazione di pattern e la morfogenesi ^1,2. Durante lo sviluppo, gli arti emergono come rigonfiamenti dalle cellule derivate dal mesoderma¹ della piastra laterale. Le gemme degli arti sono costituite da un nucleo centrale di cellule mesodermiche coperte da un ectoderma. Da questa struttura iniziale, emerge un arto intero e ben formato. Dopo che il bocciolo dell’arto si presenta, vengono riconosciuti tre assi: (1) l’asse prossima-distale ([PD] spalla alle dita), (2) l’asse dorso-ventrale ([DV] dal dorso della mano al palmo) e (3) l’anteriore-posteriore ([AP] pollice a dito). L’asse prossimale-distale dipende dalla cresta ectodermica apicale (AER), ectoderma specializzato situato sulla punta distale della gemma dell’arto. L’AER è necessario per la crescita, il mantenimento della sopravvivenza, la proliferazione e lo stato indifferenziato delle cellule che ricevono segnali ^2,3. D’altra parte, la zona di attività polarizzante (ZPA) controlla il pattern anteroposteriore⁴, mentre il pattern dorsale ed ectoderma controlla il pattern dorsoventrale ^7,8. L’integrazione della modellazione tridimensionale implica una complessa diafonia tra questi tre assi⁵. Nonostante la comprensione del percorso molecolare durante lo sviluppo degli arti, le domande aperte sui meccanismi che controllano il pattern e la corretta crescita per formare un intero arto rimangono senza risposta.

Edgar Zwilling sviluppò il sistema degli arti ricombinanti (RL) nel 1964 per studiare le interazioni tra le cellule mesenchimali degli arti e l’ectoderma nello sviluppo degli arti⁶. Il sistema RL assembla il mesoderma del germoglio dell’arto dissociato-riaggregato nell’ectoderma dell’arto embrionale per innestarlo nella parte dorsale di un embrione di pulcino donatore. I segnali forniti dall’ectoderma inducono l’espressione di geni di differenziazione e geni patterning in modo spazio-temporale, inducendo così la formazione di una struttura simile a un arto in grado di ricapitolare i programmi cellulari che si verificano durante lo sviluppo degli arti ^7,8,9.

Il modello RL è prezioso per comprendere le proprietà dei componenti degli arti e l’interazione tra cellule mesodermiche ed ectodermiche⁶. Una RL può essere definita come una struttura simile a un arto creata dall’assemblaggio sperimentale o dalla ricombinazione di cellule mesodermiche delle gemme degli arti all’interno di una copertura ectodermica⁶. La morfogenesi della RL dipende dalle caratteristiche delle cellule mesodermiche (o di altri tipi) che risponderanno ai segnali di pattern ectodermico. Uno dei vantaggi di questo sistema sperimentale è la sua versatilità. Questa caratteristica permette la creazione di combinazioni multiple variando la fonte di cellule mesodermiche, come cellule di diversi stadi di sviluppo, da diverse posizioni lungo l’arto, o cellule intere (non dissociate) o riaggregate 7,8,9,10. Un altro esempio è la capacità di ottenere l’ectoderma embrionale da specie diverse dal pollo, ad esempio la tartaruga¹¹, la quaglia o il topo¹².

In questo senso, la tecnica RL aiuta a studiare lo sviluppo degli arti e le interazioni tra cellule mesenchimali ed ectodermiche degli arti da un punto di vista evolutivo. Questa tecnica ha anche un grande potenziale per analizzare la capacità di diverse fonti di cellule progenitrici di differenziarsi in una struttura simile a un arto sfruttando i segnali forniti dall’ectoderma embrionale 12,13,14. A differenza delle colture in vitro, la RL consente di valutare la differenziazione e il potenziale morfogenetico di una popolazione cellulare interpretando i segnali embrionali provenienti da un arto in via di sviluppo ^9,15.

In questo protocollo, viene fornita una guida passo-passo per eseguire RL di successo con cellule di gemme di arti mesodermici riaggregati, aprendo così la possibilità di adattare questo protocollo con diverse fonti di cellule riaggregate o anche diverse fonti di ectoderma.

Protocol

Questa ricerca è stata esaminata e approvata dall’Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals dell’Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Città del Messico, Messico). Un diagramma di flusso schematico dei passaggi generali di questo protocollo è mostrato nella Figura 1A. 1. Incubazione embrionale e determinazione della vitalità Incubare le uova di gallina f…

Representative Results

Riconoscere un arto ricombinante ben eseguitoDopo l’innesto, gli embrioni manipolati sono stati restituiti all’incubatrice per consentire allo sviluppo della RL. Il tempo di incubazione è correlato ai requisiti dell’esperimento. Tuttavia, l’RL può essere facilmente distinto dopo 12 ore dall’impianto. Per determinare se l’impianto fosse adeguato, la RL è stata osservata come una protuberanza che era saldamente attaccata alla parete mesodermica dell’embrione donatore (Figura 2A<…

Discussion

In generale, il protocollo RL può essere suddiviso in cinque fasi: (1) incubazione embrionale, (2) ottenimento di cellule mesodermiche degli arti per riempire gli ectodermi, (3) ottenimento degli ectodermi, (4) assemblaggio di cellule mesodermiche all’interno delle coperture ectodermiche e (5) trapianto degli ectodermi riempiti negli embrioni ospiti. Il principale limite della tecnica RL è il protocollo lungo e dettagliato, che ha molti punti critici che richiedono pazienza per essere eseguiti in modo appropriato. Per …

Materials

Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01