Rekombinante lemmer er en kraftig eksperimentell modell som gjør det mulig å studere prosessen med celledifferensiering og generering av mønstre under påvirkning av embryonale signaler. Denne protokollen presenterer en detaljert metode for å generere rekombinante lemmer med kyllinglemmet-mesodermale celler, som kan tilpasses andre celletyper hentet fra forskjellige organismer.
Celledifferensiering er den finjusterte prosessen med celleforpliktelse som fører til dannelse av forskjellige spesialiserte celletyper under etableringen av å utvikle vev og organer. Denne prosessen opprettholdes aktivt i voksen alder. Celledifferensiering er en pågående prosess under utvikling og homeostase av organer. Å forstå de tidlige trinnene i celledifferensiering er viktig for å kjenne andre komplekse prosesser som morfogenese. Dermed er rekombinante kylling lemmer en eksperimentell modell som tillater studiet av celledifferensiering og mønstergenerering under embryonale mønstersignaler. Denne eksperimentelle modellen etterligner et in vivo-miljø ; Den monterer reaggregated celler i et ektodermalt deksel hentet fra en tidlig lemknopp. Senere overføres ektodermer og implanteres i en kyllingembryoreseptor for å tillate utviklingen. Denne analysen ble hovedsakelig brukt til å evaluere mesodermale lemknoppceller; Det kan imidlertid brukes på andre stamceller eller stamceller fra andre organismer.
Virveldyrlemmen er en formidabel modell for å studere celledifferensiering, celleproliferasjon, celledød, mønsterdannelse og morfogenese 1,2. Under utviklingen oppstår lemmer som buler fra cellene avledet fra lateral plate mesoderm1. Limb knopper består av en sentral kjerne av mesodermale celler dekket av et ektoderm. Fra denne tidlige strukturen dukker det opp en hel og velformet lem. Etter at lemknoppen oppstår, gjenkjennes tre akser: (1) den proximo-distale aksen ([PD] skulder ved fingre), (2) dorso-ventralaksen ([DV] fra baksiden av hånden til håndflaten), og (3) den fremre bakre ([AP] tommelen til fingeren). Den proksimale distale aksen avhenger av den apikale ektodermale ryggen (AER), spesialisert ektoderm som ligger på den distale spissen av lemknoppen. AER er nødvendig for utvekst, overlevelsesvedlikehold, spredning og den uavklarte tilstanden til celler som mottar signaler 2,3. På den annen side kontrollerer sonen for polariserende aktivitet (ZPA) anteroposterior mønster4, mens dorsal og ectoderm kontrollerer dorsoventral mønster 7,8. Integrering av tredimensjonal mønster innebærer kompleks krysstale mellom disse tre aksene5. Til tross for forståelse av den molekylære banen under lemutvikling, forblir åpne spørsmål om mekanismene som kontrollerer mønster og riktig utvekst for å danne en hel lem ubesvart.
Edgar Zwilling utviklet det rekombinante lemsystemet (RL) i 1964 for å studere samspillet mellom lemmesenchymale celler og ektodermet i utviklingen av lemmer6. RL-systemet samler det dissosierte lemknopp mesodermet inn i det embryonale lemekstodermet for å transplantere det inn i den dorsale delen av et donorkyllingembryo. Signalene fra ektodermet induserer uttrykket av differensieringsgener og mønstergener på en romlig-temporal måte, og induserer dermed dannelsen av en lemlignende struktur som kan rekapitulere celleprogrammene som oppstår under lemutvikling 7,8,9.
RL-modellen er verdifull for å forstå egenskapene til lemkomponenter og samspillet mellom mesodermale og ektodermale celler6. En RL kan defineres som en lemlignende struktur skapt av den eksperimentelt montering eller rekombinasjon av lemknopp mesodermale celler inne i et ektodermalt deksel6. Morfogenesen til RL avhenger av egenskapene til mesodermale celler (eller andre typer) som vil reagere på de ektodermale mønstersignalene. En av fordelene med dette eksperimentelle systemet er allsidigheten. Denne egenskapen tillater opprettelse av flere kombinasjoner ved å variere kilden til mesodermale celler, for eksempel celler fra forskjellige utviklingsstadier, fra forskjellige stillinger langs lemmen, eller hele (udisosierte) eller reaggregaterte celler 7,8,9,10. Et annet eksempel er evnen til å skaffe det embryonale ektodermet fra andre arter enn kylling, for eksempel skilpadde11, vaktel eller mus12.
I denne forstand bidrar RL-teknikken til å studere lemutvikling og samspillet mellom lemmesenchymale og ektodermale celler fra et evolusjonært synspunkt. Denne teknikken har også et stort potensial for å analysere evnen til forskjellige kilder til stamceller for å skille seg ut i en lemlignende struktur ved å dra nytte av signalene fra det embryonale ektodermet 12,13,14. I motsetning til in vitrokulturer tillater RL å evaluere differensierings- og morfogenetisk potensial for en cellepopulasjon ved å tolke embryonale signaler fra en utviklende lem 9,15.
I denne protokollen er det gitt en trinnvis guide til å utføre vellykket RL med reaggregated mesodermale lemknoppceller, og dermed åpne muligheten for å tilpasse denne protokollen med forskjellige kilder til reaggregated celler eller til og med forskjellige ectoderm kilder.
Generelt kan RL-protokollen deles inn i fem trinn: (1) embryoinkubasjon, (2) å skaffe lemmesodermale celler for å fylle ektodermene, (3) oppnå ektodermer, (4) montering av mesodermale celler inne i ektodermale deksler og (5) transplantasjon av de fylte ektodermene i vertsembryoene. Den største begrensningen i RL-teknikken er den lange, detaljerte protokollen, som har mange kritiske punkter som krever tålmodighet for å utføre riktig. Kritiske øyeblikk må identifiseres for å kunne fullføre protokollen. Under mes…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Estefania Garay-Pacheco for bilder i figur 2 og maria Valeria Chimal-Montes de Oca for kunstverk. Dette arbeidet ble støttet av Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [tilskuddsnumre IN211117 og IN213 og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [tilskuddsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tildelt JC-M. JC M-L mottok postdoktorstipend fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Micropipet | NA | NA | |
Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
Petri dish | Nest | 705001 | |
Pippette | crmglobe | PF1016 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
Tape | NA | NA | |
Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |