Kylling rekombinante lemmer analyse for å forstå morfogenese, mønster og tidlige trinn i celledifferensiering

Summary

Rekombinante lemmer er en kraftig eksperimentell modell som gjør det mulig å studere prosessen med celledifferensiering og generering av mønstre under påvirkning av embryonale signaler. Denne protokollen presenterer en detaljert metode for å generere rekombinante lemmer med kyllinglemmet-mesodermale celler, som kan tilpasses andre celletyper hentet fra forskjellige organismer.

Abstract

Celledifferensiering er den finjusterte prosessen med celleforpliktelse som fører til dannelse av forskjellige spesialiserte celletyper under etableringen av å utvikle vev og organer. Denne prosessen opprettholdes aktivt i voksen alder. Celledifferensiering er en pågående prosess under utvikling og homeostase av organer. Å forstå de tidlige trinnene i celledifferensiering er viktig for å kjenne andre komplekse prosesser som morfogenese. Dermed er rekombinante kylling lemmer en eksperimentell modell som tillater studiet av celledifferensiering og mønstergenerering under embryonale mønstersignaler. Denne eksperimentelle modellen etterligner et in vivo-miljø ; Den monterer reaggregated celler i et ektodermalt deksel hentet fra en tidlig lemknopp. Senere overføres ektodermer og implanteres i en kyllingembryoreseptor for å tillate utviklingen. Denne analysen ble hovedsakelig brukt til å evaluere mesodermale lemknoppceller; Det kan imidlertid brukes på andre stamceller eller stamceller fra andre organismer.

Introduction

Virveldyrlemmen er en formidabel modell for å studere celledifferensiering, celleproliferasjon, celledød, mønsterdannelse og morfogenese ^1,2. Under utviklingen oppstår lemmer som buler fra cellene avledet fra lateral plate mesoderm¹. Limb knopper består av en sentral kjerne av mesodermale celler dekket av et ektoderm. Fra denne tidlige strukturen dukker det opp en hel og velformet lem. Etter at lemknoppen oppstår, gjenkjennes tre akser: (1) den proximo-distale aksen ([PD] skulder ved fingre), (2) dorso-ventralaksen ([DV] fra baksiden av hånden til håndflaten), og (3) den fremre bakre ([AP] tommelen til fingeren). Den proksimale distale aksen avhenger av den apikale ektodermale ryggen (AER), spesialisert ektoderm som ligger på den distale spissen av lemknoppen. AER er nødvendig for utvekst, overlevelsesvedlikehold, spredning og den uavklarte tilstanden til celler som mottar signaler ^2,3. På den annen side kontrollerer sonen for polariserende aktivitet (ZPA) anteroposterior mønster⁴, mens dorsal og ectoderm kontrollerer dorsoventral mønster ^7,8. Integrering av tredimensjonal mønster innebærer kompleks krysstale mellom disse tre aksene⁵. Til tross for forståelse av den molekylære banen under lemutvikling, forblir åpne spørsmål om mekanismene som kontrollerer mønster og riktig utvekst for å danne en hel lem ubesvart.

Edgar Zwilling utviklet det rekombinante lemsystemet (RL) i 1964 for å studere samspillet mellom lemmesenchymale celler og ektodermet i utviklingen av lemmer⁶. RL-systemet samler det dissosierte lemknopp mesodermet inn i det embryonale lemekstodermet for å transplantere det inn i den dorsale delen av et donorkyllingembryo. Signalene fra ektodermet induserer uttrykket av differensieringsgener og mønstergener på en romlig-temporal måte, og induserer dermed dannelsen av en lemlignende struktur som kan rekapitulere celleprogrammene som oppstår under lemutvikling ^7,8,9.

RL-modellen er verdifull for å forstå egenskapene til lemkomponenter og samspillet mellom mesodermale og ektodermale celler⁶. En RL kan defineres som en lemlignende struktur skapt av den eksperimentelt montering eller rekombinasjon av lemknopp mesodermale celler inne i et ektodermalt deksel⁶. Morfogenesen til RL avhenger av egenskapene til mesodermale celler (eller andre typer) som vil reagere på de ektodermale mønstersignalene. En av fordelene med dette eksperimentelle systemet er allsidigheten. Denne egenskapen tillater opprettelse av flere kombinasjoner ved å variere kilden til mesodermale celler, for eksempel celler fra forskjellige utviklingsstadier, fra forskjellige stillinger langs lemmen, eller hele (udisosierte) eller reaggregaterte celler 7,8,9,10. Et annet eksempel er evnen til å skaffe det embryonale ektodermet fra andre arter enn kylling, for eksempel skilpadde¹¹, vaktel eller mus¹².

I denne forstand bidrar RL-teknikken til å studere lemutvikling og samspillet mellom lemmesenchymale og ektodermale celler fra et evolusjonært synspunkt. Denne teknikken har også et stort potensial for å analysere evnen til forskjellige kilder til stamceller for å skille seg ut i en lemlignende struktur ved å dra nytte av signalene fra det embryonale ektodermet 12,13,14. I motsetning til in vitrokulturer tillater RL å evaluere differensierings- og morfogenetisk potensial for en cellepopulasjon ved å tolke embryonale signaler fra en utviklende lem ^9,15.

I denne protokollen er det gitt en trinnvis guide til å utføre vellykket RL med reaggregated mesodermale lemknoppceller, og dermed åpne muligheten for å tilpasse denne protokollen med forskjellige kilder til reaggregated celler eller til og med forskjellige ectoderm kilder.

Protocol

Denne forskningen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board for care and use of Laboratory Animals of the Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico). Et skjematisk flytskjema over de generelle trinnene i denne protokollen vises i figur 1A. 1. Embryoinkubasjon og bestemmelse av levedyktighet Inkuber befruktede kyllingegg ved 38 °C og 60 % relativ fuktig…

Representative Results

Gjenkjenne en godt utført rekombinant lemEtter podning ble de manipulerte embryoene returnert til inkubatoren for å tillate RL å utvikle seg. Inkubasjonstiden korrelerte med kravene til eksperimentet. Likevel kan RL lett skille seg ut etter 12 timers implantasjon. For å avgjøre om implantasjonen var tilstrekkelig, ble RL observert som et fremspring som var sikkert festet til donorembryoens mesodermale vegg (figur 2A). Tvert imot, enten enten celle levedyktighet og /…

Discussion

Generelt kan RL-protokollen deles inn i fem trinn: (1) embryoinkubasjon, (2) å skaffe lemmesodermale celler for å fylle ektodermene, (3) oppnå ektodermer, (4) montering av mesodermale celler inne i ektodermale deksler og (5) transplantasjon av de fylte ektodermene i vertsembryoene. Den største begrensningen i RL-teknikken er den lange, detaljerte protokollen, som har mange kritiske punkter som krever tålmodighet for å utføre riktig. Kritiske øyeblikk må identifiseres for å kunne fullføre protokollen. Under mes…

Materials

Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01