Forværring af myokardieiskæmi ved eksponering for partikler i aterosklerose dyremodel

Summary

Denne protokol beskriver en sammensat dyremodel med eksponering for partikler (PM), der forværrer myokardieiskæmi med aterosklerose.

Abstract

De sundhedsmæssige problemer forårsaget af luftforurening (især partikelforurening) får mere og mere opmærksomhed, især blandt patienter med hjerte-kar-sygdomme, hvilket forværrer komplicerede lidelser og forårsager dårlig prognose. Den enkle myokardieiskæmi (MI) eller partikler (PM) eksponeringsmodel er uegnet til sådanne undersøgelser af sygdomme med flere årsager. Her er en metode til konstruktion af en sammensat model, der kombinerer PM-eksponering, aterosklerose og myokardieiskæmi, blevet beskrevet. ApoE−^/− mus blev fodret med en fedtrig kost i 16 uger for at udvikle aterosklerose, trakealinstillation af PM-standardsuspension blev udført for at simulere lungeeksponeringen af PM, og den venstre forreste faldende kranspulsåre blev ligeret en uge efter den sidste eksponering. Trakeal instillation af PM kan simulere akut lungeeksponering og samtidig reducere omkostningerne ved eksperimentet betydeligt; Den klassiske venstre forreste faldende arterieligation med ikke-invasiv trakealintubation og en ny hjælpeudvidelsesanordning kan sikre dyrets overlevelsesrate og reducere vanskeligheden ved operationen. Denne dyremodel kan med rimelighed simulere patientens patologiske ændringer af myokardieinfarkt forværret af luftforurening og give en reference til konstruktion af dyremodeller relateret til undersøgelser, der involverer sygdomme med flere årsager.

Introduction

Luftforurening har været forbundet med høj dødelighed af alle årsager og bidraget med en betydelig sygdomsbyrde mere end summen af vandforurening, jordforurening og erhvervsmæssig eksponering¹. En rapport fra WHO afslørede, at udendørs luftforurening forårsagede 4,2 millioner for tidlige dødsfald i både byer og landdistrikter verden over i 2016². 91% af mennesker verden over bor på steder, hvor luftkvaliteten overstiger WHO’s vejledende grænser². Endvidere anerkendes de fine partikler (PM) (≤2,5 μm i diameter, PM_2,5) som den mest betydningsfulde luftforureningstrussel mod den globale folkesundhed³, især for de mennesker, der bor i byer i lavindkomst- og mellemindkomstlande.

De negative virkninger af luftforurening på hjerte-kar-sygdomme fortjener mere opmærksomhed. Tidligere undersøgelser har vist, at PM fører til en øget risiko for hjerte-kar-sygdomme (CVD’er)⁴. Eksponering for høje koncentrationer af ultrafine partikler i flere timer kan føre til øget myokardieinfarktdødelighed. For personer med en historie med myokardieinfarkt kan eksponering for ultrafine partikler øge risikoen for gentagelse 5^betydeligt. Desuden er det almindeligt accepteret, at PM-eksponering fremskynder udviklingen af aterosklerose⁶.

Til medicinsk forskning er det afgørende at vælge en passende dyremodel. Simple aterosklerose dyremodeller⁷, myokardieiskæmi dyremodeller⁸ og PM-eksponering dyremodeller⁹ findes allerede. ApoE−^/− (apolipoprotein E slået ud) mus er en traditionel musemodel, der anvendes i aterosklerosestudier. Evnen til at fjerne plasmalipoproteiner i ApoE−^/− mus er alvorligt svækket. Den fedtfattige diætfodring ville forårsage alvorlig aterosklerose, der ligner diætafhængigheden af aterosklerotisk hjertesygdom observeret hos mennesker⁷. Ligering af den venstre forreste faldende kranspulsåre (LAD) er en klassisk metode til at inducere den iskæmiske hændelse ^8,10. Trakeal infusion er blevet brugt i mange undersøgelser og skiller sig ud fra eksponeringsmodeller^11,12 på grund af dens bedre simulering og lavere omkostninger.

Imidlertid har dyremodeller af enkelt sygdom betydelige begrænsninger i videnskabelig forskning. Den myokardieiskæmi, der kun induceres af LAD-ligering, simuleres ikke i den aktuelle situation. I den naturlige tilstand er myokardieiskæmi normalt forårsaget af plaquebrud og blokerede koronararterier¹³. Patienter med iskæmisk kardiomyopati har normalt aterosklerotiske grundlæggende læsioner¹³. Der er også unormal lipidmetabolisme og inflammatoriske reaktioner i kroppen¹⁴. Derfor har iskæmi forårsaget af fysiske faktorer eller under naturlige forhold forskellige patologiske manifestationer. Eksisterende undersøgelser har vist, at infarkt og betændelse i myokardieiskæmimodeller med aterosklerose er mere alvorlige^15,16. PM-eksponering kan forværre aterosklerose og myokardieiskæmi yderligere ved at fremkalde betændelse og oxidativ stress¹. Tre faktorer eksisterer normalt sammen i den naturlige tilstand, så den faktiske situation kunne simuleres bedre ved hjælp af en sammensat model.

Denne protokol beskriver udvikling af en dyremodel af myokardieiskæmi (MI), der kombinerer aterosklerose (AS) og PM akut eksponering. ApoE−^/− mus blev fodret med en fedtfattig kost for at fremkalde åreforkalkning. Lungeeksponering af PM blev efterlignet ved dryppende PM-suspension gennem luftrøret. Ligation af LAD hos mus blev brugt til at inducere myokardieiskæmi. Disse metoder blev kombineret og optimeret til at simulere sygdomstilstanden bedre og forbedre dyrenes overlevelsesrate. Der er ikke behov for nogen stor eksponeringsenhed eller gasbedøvelsesmaskine, hvilket gør eksperimentet let at udføre. Denne model kan bruges til at studere virkningen af PM-eksponering i luftforurening på aterosklerose og iskæmisk kardiomyopati og udføre forskning i nye lægemidler udviklet til behandling af sygdomme med sådanne komplekse faktorer.

Protocol

Alle dyreaktiviteter beskrevet her blev godkendt af dyreetisk komité ved Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences. Hanmus (C57BL/6 baggrund) på 6-8 uger blev brugt til undersøgelsen. 1. Eksperimentelt præparat Tilbered tribromethanolanæstetika (15 mg/ml): Opløs 0,75 g tribromoethanol i 1 ml tert-amylalkohol (se Materialetabel). Efter fuldstændig opløsning fortyndes det til 50 ml med sterilt sal…

Representative Results

Musene blev aflivet 24 timer efter kranspulsåreligationen, og blodet blev indsamlet efter bedøvelse. Mus blev bedøvet af tribromoethanol (i henhold til trin 3.2), og blodprøven blev indsamlet fra den retroorbitale sinus. Hjertet blev høstet, og graden af iskæmi blev undersøgt ved 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) farvning (figur 1). Normalt væv bliver rødt, når TTC reagerer med succinatdehydrogenase, mens det iskæmiske væv forbliver blegt på grund af nedsa…

Discussion

Etableringen af en sammensat dyremodel er lidt anderledes end den enkelte MI-model. Opretholdelse af en høj overlevelsesrate er udfordrende i udviklingen af den sammensatte model. Sværhedsgraden af åreforkalkning hos ApoE−^/− mus vil blive mere alvorlig med forlængelsen af fodringstiden med højt fedtindhold⁷, og musenes svaghed fører til øget dødelighed. Derfor er det nødvendigt løbende at overvåge musenes tilstand under forsøget og justere tiden for at fremkalde årefork…

Materials

2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
75% alcohol disinfectant
Animal ventilator	Shanghai Alcott Biotech	ALC-V8S
Cotton swabs			Sterile
Cotton swabs for babies			Sterile , Approximately 3 mm in diameter
Culture Dish	Corning	430597	150 mm x 25 mm
Diesel Particulate Matter	National Institute of Standards Technology	1650b
Dissection board			About 25 x 17 cm. The dissecting board can be replaced with a wooden board of the same size
High-fat diet for mice			Prescription: egg yolk powder 10%, lard 10%, sterol 1%, maintenance feed 79%
Iodophor disinfectant
LED spotlight			5 V, 3 W,with hoses and clamps
Medical silk yarn ball	Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd.	–	0-0
Medical tape	3M	1527C-0
Micro Vascular Hemostatic Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	W40350
Needle Holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JC32010
Normal saline
Ophthalmic Scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	Y00040
Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with hooks	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JD1080
Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with teeth	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JD1060
Pipet Tips	Axygen	T-200-Y-R-S	0-200 μL
Pipette	eppendorf	3121000074	100 uL
Safety pin			Approximately 4.5 cm in length , for making chest opening tools
Small Animal I.V. Cannulas	Baayen healthcare suzhou	BAAN-322025	I.V CATHETER 22FG x 25 MM
Suture needle with thread	Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd.	–	6-0,Nylon line
Suture needle with thread	JinHuan Medical	F503	5-0
Syringe			1 mL
Tert-amyl alcohol
Zoom-stereo microscope	Mshot	MZ62