Aggravamento dell'ischemia miocardica in seguito all'esposizione al particolato in un modello animale di aterosclerosi

Summary

Questo protocollo descrive un modello animale composito con esposizione al particolato (PM) che aggrava l’ischemia miocardica con aterosclerosi.

Abstract

I problemi di salute causati dall’inquinamento atmosferico (in particolare l’inquinamento da particolato) stanno ricevendo sempre più attenzione, soprattutto tra i pazienti con malattie cardiovascolari, il che aggrava i disturbi complicati e causa una prognosi infausta. Il modello di esposizione semplice all’ischemia miocardica (MI) o al particolato (PM) non è adatto per tali studi su malattie con cause multiple. Qui è stato descritto un metodo per costruire un modello composito che combina esposizione al PM, aterosclerosi e ischemia miocardica. I topi ApoE^{-/− sono} stati nutriti con una dieta ricca di grassi per 16 settimane per sviluppare l’aterosclerosi, l’instillazione tracheale della sospensione standard di PM è stata eseguita per simulare l’esposizione polmonare di PM e l’arteria coronaria discendente anteriore sinistra è stata legata una settimana dopo l’ultima esposizione. L’instillazione tracheale di PM può simulare l’esposizione polmonare acuta riducendo significativamente il costo dell’esperimento; La classica legatura dell’arteria discendente anteriore sinistra con intubazione tracheale non invasiva e un nuovo dispositivo di espansione ausiliaria possono garantire il tasso di sopravvivenza dell’animale e ridurre la difficoltà dell’operazione. Questo modello animale può ragionevolmente simulare i cambiamenti patologici del paziente di infarto miocardico aggravato dall’inquinamento atmosferico e fornire un riferimento per la costruzione di modelli animali relativi a studi che coinvolgono malattie con molteplici cause.

Introduction

L’inquinamento atmosferico è stato associato ad un’elevata mortalità per tutte le cause e ha contribuito a un carico significativo di malattie più della somma dell’inquinamento delle acque, dell’inquinamento del suolo e dell’esposizione professionale¹. Un rapporto dell’OMS ha rivelato che l’inquinamento atmosferico esterno ha causato 4,2 milioni di morti premature sia nelle città che nelle aree rurali di tutto il mondo nel 2016². Il 91% delle persone in tutto il mondo vive in luoghi in cui la qualità dell’aria supera i limiti delle linee guida dell’OMS². Inoltre, il particolato fine (PM) (≤2,5 μm di diametro, PM_2,5) è riconosciuto come la minaccia più significativa per l’inquinamento atmosferico per la salute pubblica globale³, in particolare per le persone che vivono in città di paesi a basso e medio reddito.

Gli effetti negativi dell’inquinamento atmosferico sulle malattie cardiovascolari meritano maggiore attenzione. Studi precedenti hanno dimostrato che il PM porta ad un aumento del rischio di malattie cardiovascolari (CVD)⁴. L’esposizione ad alte concentrazioni di particelle ultrafini per diverse ore può portare ad un aumento della mortalità per infarto miocardico. Per le persone con una storia di infarto miocardico, l’esposizione a particelle ultrafini può aumentare significativamente il rischio di recidiva⁵. Inoltre, è generalmente accettato che l’esposizione al PM accelera la progressione dell’aterosclerosi⁶.

Per la ricerca medica, è fondamentale selezionare un modello animale adatto. Esistono già modelli animali di aterosclerosi semplice⁷, modelli animali di ischemia miocardica⁸ e modelli animali di esposizione al PM⁹. Il topo ApoE−^/− (apolipoproteina E eliminata) è un modello murino tradizionale utilizzato negli studi sull’aterosclerosi. La capacità di eliminare le lipoproteine plasmatiche nei topi ApoE^−/− è gravemente compromessa. L’alimentazione con dieta ricca di grassi causerebbe grave aterosclerosi, simile alla dipendenza dalla dieta della cardiopatia aterosclerotica osservata negli esseri umani⁷. La legatura dell’arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) è un metodo classico per indurre l’evento ischemico ^8,10. L’infusione tracheale è stata utilizzata in molte ricerche e si distingue dai modelli di esposizione^11,12 per la sua migliore simulazione e il costo inferiore.

Tuttavia, i modelli animali di singola malattia hanno limitazioni significative nella ricerca scientifica. L’ischemia miocardica indotta semplicemente dalla legatura LAD non è simulata nella situazione reale. Nello stato naturale, l’ischemia miocardica è solitamente causata dalla rottura della placca e dalle arterie coronarie bloccate¹³. I pazienti con cardiomiopatia ischemica di solito presentano lesioni basiche aterosclerotiche¹³. Ci sono anche metabolismo lipidico anormale e reazioni infiammatorie nel corpo¹⁴. Pertanto, l’ischemia causata da fattori fisici o in condizioni naturali ha diverse manifestazioni patologiche. Studi esistenti hanno dimostrato che l’infarto e l’infiammazione nei modelli di ischemia miocardica con aterosclerosi sono più gravi^15,16. L’esposizione al PM può aggravare ulteriormente l’aterosclerosi e l’ischemia miocardica inducendo infiammazione e stress ossidativo¹. Tre fattori di solito coesistono allo stato naturale, quindi la situazione reale potrebbe essere meglio simulata utilizzando un modello composto.

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello animale di ischemia miocardica (IM) che combina aterosclerosi (AS) ed esposizione acuta al PM. I topi ApoE^{-/− sono} stati nutriti con una dieta ricca di grassi per indurre l’aterosclerosi. L’esposizione polmonare di PM è stata imitata gocciolando la sospensione di PM attraverso la trachea. La legatura del LAD nei topi è stata utilizzata per indurre ischemia miocardica. Questi metodi sono stati combinati e ottimizzati per simulare meglio lo stato della malattia e migliorare il tasso di sopravvivenza degli animali. Non è necessaria alcuna unità di grande esposizione o macchina per anestesia a gas, rendendo l’esperimento facile da eseguire. Questo modello può essere utilizzato per studiare l’impatto dell’esposizione al PM nell’inquinamento atmosferico sull’aterosclerosi e sulla cardiomiopatia ischemica e condurre ricerche su nuovi farmaci sviluppati per trattare malattie con fattori così complessi.

Protocol

Tutte le attività animali qui descritte sono state approvate dal Comitato etico animale dell’Istituto di materia medica cinese, Accademia cinese delle scienze mediche cinesi. Per lo studio sono stati utilizzati topi maschi ApoE−/− (sfondo C57BL/6) di 6-8 settimane di età. 1. Preparazione sperimentale Preparare anestetici a tribromoetanolo (15 mg/ml): sciogliere 0,75 g di tribromoetanolo in 1 mL di alcool terz-amilico (vedere Tabella dei mater…

Representative Results

I topi sono stati sottoposti a eutanasia 24 ore dopo la legatura dell’arteria coronaria e il sangue è stato raccolto dopo l’anestesia. I topi sono stati anestetizzati con tribromoetanolo (come da fase 3.2) e il campione di sangue è stato raccolto dal seno retroorbitale. Il cuore è stato prelevato e il grado di ischemia è stato esaminato mediante colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (Figura 1). I tessuti normali diventano rossi quando il TTC reagisce …

Discussion

La creazione di un modello animale composito è leggermente diversa dal modello MI singolo. Mantenere un alto tasso di sopravvivenza è impegnativo nello sviluppo del modello composito. La gravità dell’aterosclerosi nei topi ApoE^−/− diventerà più grave con l’estensione del tempo di alimentazione ad alto contenuto di grassi⁷ e la debolezza dei topi porta ad un aumento della mortalità. Pertanto, è necessario monitorare continuamente le condizioni dei topi durante l’esperimento e …

Materials

2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
75% alcohol disinfectant
Animal ventilator	Shanghai Alcott Biotech	ALC-V8S
Cotton swabs			Sterile
Cotton swabs for babies			Sterile , Approximately 3 mm in diameter
Culture Dish	Corning	430597	150 mm x 25 mm
Diesel Particulate Matter	National Institute of Standards Technology	1650b
Dissection board			About 25 x 17 cm. The dissecting board can be replaced with a wooden board of the same size
High-fat diet for mice			Prescription: egg yolk powder 10%, lard 10%, sterol 1%, maintenance feed 79%
Iodophor disinfectant
LED spotlight			5 V, 3 W,with hoses and clamps
Medical silk yarn ball	Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd.	–	0-0
Medical tape	3M	1527C-0
Micro Vascular Hemostatic Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	W40350
Needle Holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JC32010
Normal saline
Ophthalmic Scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	Y00040
Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with hooks	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JD1080
Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with teeth	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JD1060
Pipet Tips	Axygen	T-200-Y-R-S	0-200 μL
Pipette	eppendorf	3121000074	100 uL
Safety pin			Approximately 4.5 cm in length , for making chest opening tools
Small Animal I.V. Cannulas	Baayen healthcare suzhou	BAAN-322025	I.V CATHETER 22FG x 25 MM
Suture needle with thread	Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd.	–	6-0,Nylon line
Suture needle with thread	JinHuan Medical	F503	5-0
Syringe			1 mL
Tert-amyl alcohol
Zoom-stereo microscope	Mshot	MZ62