Uso de la optogenética para revertir la neuroplasticidad e inhibir la búsqueda de cocaína en ratas
Summary
Los métodos descritos aquí describen un procedimiento utilizado para revertir optogenéticamente la plasticidad inducida por la cocaína en un circuito conductualmente relevante en ratas. La estimulación óptica sostenida de baja frecuencia de las sinapsis tálamo-amígdala induce depresión a largo plazo (LTD). La LTD inducida optogenéticamente in vivo en ratas experimentadas con cocaína resultó en la posterior atenuación de la búsqueda de drogas motivada por señales.
Abstract
Este protocolo demuestra los pasos necesarios para usar herramientas optogenéticas para revertir la plasticidad inducida por la cocaína en los circuitos tálamo-amígdala para reducir los comportamientos posteriores de búsqueda de cocaína en la rata. En nuestra investigación, descubrimos que cuando las ratas se autoadministran cocaína intravenosa combinada con una señal audiovisual, las sinapsis formadas en las entradas del núcleo geniculado medial del tálamo (MGN) en las neuronas principales de la amígdala lateral (LA) se vuelven más fuertes a medida que se aprende la asociación señal-cocaína. Planteamos la hipótesis de que la reversión de la plasticidad inducida por la cocaína en estas sinapsis reduciría el comportamiento de búsqueda de cocaína motivado por señales. Para lograr este tipo de neuromodulación in vivo, queríamos inducir la depresión sináptica a largo plazo (LTD), que disminuye la fuerza de las sinapsis MGN-LA. Para ello, utilizamos la optogenética, que permite la neuromodulación de los circuitos cerebrales utilizando la luz. La opsina excitatoria oChiEF se expresó en terminales MGN presinápticos en el LA mediante la infusión de un AAV que contenía oChiEF en el MGN. Luego se implantaron fibras ópticas en el LA y se pulsó luz láser de 473 nm a una frecuencia de 1 Hz durante 15 minutos para inducir LTD y revertir la plasticidad inducida por la cocaína. Esta manipulación produce una reducción duradera en la capacidad de las señales asociadas con la cocaína para inducir acciones de búsqueda de drogas.
Introduction
El abuso de sustancias es un problema de salud pública muy grave en los Estados Unidos y en todo el mundo. A pesar de décadas de intensa investigación, hay muy pocas opciones terapéuticas efectivas 1,2. Un revés importante para el tratamiento es el hecho de que el uso crónico de drogas genera recuerdos asociativos a largo plazo entre las señales ambientales y la droga en sí. La reexposición a señales relacionadas con las drogas impulsa respuestas fisiológicas y conductuales que motivan el uso continuo de drogas y la recaída3. Una estrategia terapéutica novedosa es promulgar tratamientos basados en la memoria que tienen como objetivo manipular los circuitos involucrados en la regulación de las asociaciones de señales de drogas. Recientemente, se observó que las sinapsis en la amígdala lateral (LA), específicamente las que surgen del núcleo geniculado medial (MGN) del tálamo, se fortalecen con la autoadministración repetida de cocaína asociada a la señal, y que esta potenciación puede apoyar el comportamiento de búsqueda de cocaína 4,5. Por lo tanto, se propuso que la reincorporación inducida por señales podría atenuarse invirtiendo la plasticidad en las sinapsis MGN-LA.
La capacidad de apuntar con precisión a la plasticidad sináptica de un circuito cerebral específico ha sido un gran desafío para el campo. Las herramientas farmacológicas tradicionales han tenido cierto éxito en la disminución de los comportamientos de recaída, pero están limitadas por la incapacidad de manipular las sinapsis individuales. Sin embargo, el reciente desarrollo de la optogenética in vivo ha proporcionado las herramientas necesarias para superar estas limitaciones y controlar las vías neuronales con precisión temporal y espacial 6,7,8. Al expresar opsinas sensibles a la luz en un circuito cerebral específico, la luz láser se puede usar para activar o inhibir el circuito. La estimulación óptica dependiente de la frecuencia se puede utilizar para manipular específicamente la plasticidad sináptica del circuito en un animal que se comporta.
Este manuscrito describe el procedimiento tomado para manipular el circuito MGN-LA relevante para el comportamiento utilizando optogenética in vivo . En primer lugar, la opsina excitatoria oChIEF se expresó en el MGN y las fibras ópticas se implantaron bilateralmente en el LA. Luego, los animales fueron entrenados para autoadministrarse cocaína de una manera dependiente de la señal, lo que potencia la vía MGN-LA. A continuación, se utilizó estimulación sostenida de baja frecuencia con luz láser de 473 nm para producir LTD específico para el circuito. Revertir la plasticidad inducida por el consumo de cocaína generó una reducción duradera en la capacidad de las señales para desencadenar acciones que están asociadas con el comportamiento de búsqueda de drogas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se describió anteriormente, hay varios pasos críticos que son importantes para lograr los resultados experimentales adecuados. Es probable que el protocolo solo sea efectivo en animales que adquieran adecuadamente la autoadministración de cocaína, y hasta la fecha, solo se ha probado utilizando los parámetros descritos anteriormente. Es posible que la dosis de cocaína, el programa de refuerzo y los parámetros de señal puedan modificarse con probablemente poco efecto sobre los resultados conductuales, con la …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo de las subvenciones de USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) y el Departamento de Salud de Pensilvania.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
Referências
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
