यह आलेख मेलेनोमा मेटास्टेसिस के उपन्यास उम्मीदवार मध्यस्थों और कार्रवाई के उनके तंत्र (ओं) के परीक्षण के लिए नियोजित तकनीकों के एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।
मेटास्टेसिस एक जटिल प्रक्रिया है, जिसमें कोशिकाओं को उन बाधाओं को दूर करने की आवश्यकता होती है जो केवल इन विट्रो एसेस द्वारा अपूर्ण रूप से मॉडलिंग की जाती हैं। मेलेनोमा मेटास्टेसिस में उपन्यास खिलाड़ियों की पहचान करने के लिए विवो मॉडल और मानकीकृत तरीकों में मजबूत, पुन: प्रस्तुत करने योग्य का उपयोग करके एक व्यवस्थित वर्कफ़्लो स्थापित किया गया था। यह दृष्टिकोण मेटास्टेसिस में जीन की भूमिका को ठीक से चिह्नित करने के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक चरणों में डेटा अनुमान की अनुमति देता है। मॉडल चूहों में इंट्राकार्डियक, इंट्राडर्मल, या चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित मेलेनोमा कोशिकाओं को पेश करके स्थापित किए जाते हैं, इसके बाद विवो इमेजिंग में सीरियल के साथ निगरानी की जाती है। एक बार जब पूर्वस्थापित समापन बिंदु तक पहुंच जाते हैं, तो प्राथमिक ट्यूमर और / या मेटास्टेसिस-असर अंगों को काटा जाता है और विभिन्न विश्लेषणों के लिए संसाधित किया जाता है। ट्यूमर कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया जा सकता है और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण सहित कई ‘ओमिक्स’ प्लेटफार्मों में से किसी के अधीन किया जा सकता है। अंगों को मेटास्टेसिस के समग्र बोझ को मापने और उनके विशिष्ट शारीरिक स्थान को मैप करने के लिए इमेजिंग और इम्यूनोहिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण से गुजरना पड़ता है। इस अनुकूलित पाइपलाइन, engraftment, निगरानी, ऊतक कटाई, प्रसंस्करण, और विश्लेषण के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल सहित, रोगी व्युत्पन्न, अल्पकालिक संस्कृतियों और विभिन्न ठोस कैंसर प्रकारों की स्थापित मानव और murine सेल लाइनों के लिए अपनाया जा सकता है।
मेटास्टैटिक मेलेनोमा से जुड़ी उच्च मृत्यु दर दुनिया भर में मेलेनोमा की बढ़ती घटनाओं के साथ संयुक्तहै 1 (2025 तक अनुमानित 7.86% वृद्धि) नए उपचार दृष्टिकोणों के लिए कॉल करती है। लक्ष्य खोज में प्रगति मेटास्टेसिस के पुनरुत्पादक मॉडल पर टिकी हुई है, जो एक अत्यधिक जटिल प्रक्रिया है। मेटास्टैटिक कैस्केड के चरणों के दौरान, मेलेनोमा कोशिकाओं को प्रतिरक्षा प्रणाली की चोरी औरदूर के ऊतकों के उपनिवेशीकरण को प्राप्त करने के लिए अनगिनत बाधाओं को दूर करना चाहिए। मेलेनोमा कोशिकाओं की लचीलापन और अनुकूलन क्षमता कारकों की एक भीड़ से उत्पन्न होती है, जिसमें उनके उच्च आनुवंशिक उत्परिवर्तनीय बोझ3 और उनके तंत्रिका शिखा मूल शामिल हैं, जो महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी 3,4,5 प्रदान करते हैं। प्रत्येक चरण में, ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रम मेटास्टेसाइज़िंग मेलेनोमा कोशिकाओं को माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ क्रॉसस्टॉक से संकेतों के आधार पर एक राज्य से दूसरे राज्य में स्विच करने की अनुमति देते हैं, जिसमें प्रतिरक्षा प्रणाली6, एक्स्ट्रासेल्युलर परिवेश 7,8 और भौतिक बाधाओं की सेलुलर वास्तुकलाशामिल है जिसके साथ वे संपर्क में आते हैं। उदाहरण के लिए, मेलेनोमा कोशिकाएं महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा-प्राइमिंग ट्यूमर-स्रावित कारकों की अभिव्यक्ति को कम करके प्रतिरक्षा निगरानी से बच जातीहैं।
अध्ययन एक “प्रीमेटास्टेटिक आला” का वर्णन करते हैं, जिसमें मेलेनोमा कोशिकाएं मेटास्टेसिस10 के लिए दूर के “लक्ष्य” अंग को प्राइम करने के लिए केमोकाइन्स और साइटोकिन्स को स्रावित करती हैं। ये निष्कर्ष मेटास्टैटिक मेलेनोमा कोशिकाओं के अंग ट्रोपिज़्म और शारीरिक मार्ग के बारे में महत्वपूर्ण सवाल उठाते हैं जो वे दूर के ऊतकों तक पहुंचने के लिए लेते हैं। इंट्रावेसेशन के बाद, मेलेनोमा कोशिकाओं को लसीका (लसीका प्रसार) और रक्त वाहिकाओं (हेमटोजेनस स्प्रेड) 2,11 के माध्यम से मेटास्टेसाइज़ करने के लिए जाना जाता है। जबकि अधिकांश रोगी स्थानीयकृत बीमारी के साथ मौजूद होते हैं, मामलों का एक छोटा सबसेट दूर के मेटास्टैटिक रोग और कोई लसीका प्रसार (नकारात्मक लिम्फ नोड भागीदारी) 11 के साथ प्रस्तुत करता है, जो मेलेनोमा के लिए वैकल्पिक मेटास्टैटिक मार्गों के अस्तित्व का सुझाव देता है।
जब वे एक मेटास्टैटिक साइट का उपनिवेश करते हैं, तो मेलेनोमा कोशिकाएं एपिजेनेटिक और चयापचय अनुकूलन12,13 से गुजरती हैं। नए डिब्बों तक पहुंचने और आक्रमण करने के लिए, मेलेनोमा कोशिकाएं प्रोटीज14 और साइटोस्केलेटल संशोधनोंको 11,15 को नियोजित करती हैं, जो उन्हें अपने नए स्थान पर जाने और बढ़ने में सक्षम बनाती हैं। मेलेनोमा कोशिकाओं को लक्षित करने में कठिनाई इस तरह के अनुकूलन की जटिलता और संख्या में रहती है; इस प्रकार, क्षेत्र को प्रयोगात्मक रूप से कई चरणों और अनुकूलनों को यथासंभव फिर से बनाने के प्रयास करने चाहिए। इन विट्रो assays जैसे organoids और 3 डी संस्कृतियों16,17 में कई प्रगति के बावजूद, इन मॉडलों को केवल अपूर्ण रूप से vivo मेटास्टैटिक कैस्केड में recapitulate.
मुरीन मॉडल ने पुनरुत्पादन, तकनीकी व्यवहार्यता और मानव रोग के सिमुलेशन के बीच संतुलन बनाकर मूल्य दिखाया है। Intravascularly, orthotopically और heterotopically प्रत्यारोपित मेलेनोमा कोशिकाओं रोगी व्युत्पन्न या अल्पकालिक संस्कृतियों से प्रतिरक्षा-समझौता या मानवीकृत चूहों में मेटास्टैटिक मेलेनोमा में लक्ष्य खोज की रीढ़ का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों में अक्सर मेटास्टेसिस पर एक महत्वपूर्ण जैविक बाधा की कमी होती है: प्रतिरक्षा प्रणाली। Syngeneic मेलेनोमा मेटास्टेसिस मॉडल जो इस बाधा के अधिकारी हैं, क्षेत्र में अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं। इन प्रणालियों, B16-F1018, सेल लाइनों19, SM1 20, D4M3 21, RIM3 22या अधिक हाल ही में, RMS 23 और M1 (Mel114433),M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 मेलेनोमा सेल लाइनों के YUMM परिवार सहित immunocompetent चूहों में विकसित, मेलेनोमा प्रगति में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जटिल भूमिका की जांच की सुविधा प्रदान करते हैं।
यहां, मेलेनोमा मेटास्टेसिस लक्ष्य पहचान के लिए एक पाइपलाइन प्रस्तुत की गई है। मेलेनोमा रोगी साथियों से उत्पन्न होने वाले बढ़ते और बड़े ‘ओमिक्स’ डेटासेट के साथ, हम मानते हैं कि सबसे अधिक नैदानिक वादा करने वाले अध्ययन वे हैं जो बड़े डेटा एकीकरण से स्टेम करते हैं, जिससे सावधानीपूर्वक कार्यात्मक और यंत्रवत पूछताछहोती है 25,26,27,28। मेटास्टैटिक प्रक्रिया में संभावित लक्ष्यों का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल का उपयोग करके, कोई भी विवो-विशिष्ट घटनाओं और ऊतक इंटरैक्शन में खाता कर सकता है, इस प्रकार नैदानिक अनुवाद की संभावना बढ़ जाती है। मेटास्टैटिक बोझ को मापने के लिए कई तरीकों को रेखांकित किया गया है, जो किसी भी दिए गए प्रयोग के परिणामों पर पूरक डेटा प्रदान करता है। विभिन्न अंगों में ट्यूमर से एकल-सेल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल को मेटास्टैटिक कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के निष्पक्ष लक्षण वर्णन की सहायता के लिए वर्णित किया गया है, जो एकल-सेल या थोक आरएनए अनुक्रमण से पहले हो सकता है।
इस तकनीकी रिपोर्ट का उद्देश्य मेलेनोमा मेटास्टेसिस में संभावित अभिनेताओं की जांच के लिए एक मानकीकृत, शीर्ष-से-नीचे वर्कफ़्लो की पेशकश करना है। जैसा कि विवो प्रयोगों में महंगा और समय लेने वाला हो स?…
The authors have nothing to disclose.
हम NYU Langone स्वास्थ्य में उन्नत अनुसंधान प्रौद्योगिकियों (DART) के प्रभाग को धन्यवाद देते हैं, और विशेष रूप से, प्रयोगात्मक पैथोलॉजी अनुसंधान प्रयोगशाला, जीनोम प्रौद्योगिकी केंद्र, साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग प्रयोगशाला, पूर्व-नैदानिक इमेजिंग कोर, जो आंशिक रूप से Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087 द्वारा समर्थित हैं। हम NYU अंतःविषय मेलेनोमा सहकारी समूह (पीआई: डॉ इमान उस्मान) को रोगी-व्युत्पन्न मेलेनोमा अल्पकालिक संस्कृतियों + (10-230बीएम और 12-273बीएम) तक पहुंच प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं, जो आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल (यूनिवर्सल सहमति अध्ययन #s16-00122 और अंतःविषय मेलेनोमा सहकारी समूह अध्ययन # 10362) के माध्यम से प्राप्त किए गए थे। हम डॉ रॉबर्ट केर्बेल (टोरंटो विश्वविद्यालय) को 113/6-4L और 131/4-5B1 मेलेनोमा सेल लाइनों * और डॉ. मीनहार्ड हर्लिन (Wistar Institute) को WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 मेलेनोमा अल्पकालिक संस्कृतियों ** प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। ई.एच. एनआईएच / एनसीआई आर01सीए243446, P01CA206980, एक अमेरिकन कैंसर सोसाइटी-मेलेनोमा रिसर्च एलायंस टीम साइंस अवार्ड, और एक एनआईएच मेलानोमा स्पोर (NCI P50 CA225450) द्वारा समर्थित है; पीआई: आई.ओ.)। चित्रा 1 Biorender.com के साथ बनाया गया था।
#15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
#3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |