JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

التحقيق في استقلاب القلب في قلب الفأر المعزول مع التحليل الطيفي للتصوير بالرنين المغناطيسي النووي [1-13 C] و 13C / 31P NMR

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

نحن نصف إعدادا تجريبيا لإدارة مستقلبات 13ذات علامة C شديدة الاستقطاب في وضع التروية المستمرة إلى قلب فأر معزول. مكن نهج اكتساب 13C-NMR المخصص من القياس الكمي لنشاط الإنزيم الأيضي في الوقت الفعلي ، ومكن تحليل 31P-NMR متعدد المعلمات من تحديد محتوى ATP في الأنسجة ودرجة الحموضة.

Abstract

الأيض هو أساس العمليات الهامة في الحياة الخلوية. يوفر توصيف كيفية عمل الشبكات الأيضية في الأنسجة الحية معلومات مهمة لفهم آلية الأمراض وتصميم العلاجات. في هذا العمل ، نصف الإجراءات والمنهجيات لدراسة النشاط الأيضي داخل الخلية في قلب فأر معطر بأثر رجعي في الوقت الفعلي. تم عزل القلب في الموقع ، بالتزامن مع السكتة القلبية لتقليل نقص تروية عضلة القلب وتم اختراقه داخل مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR). أثناء وجوده في مقياس الطيف وتحت التروية المستمرة ، تم إعطاء البيروفات مفرط الاستقطاب [1-13 درجة مئوية] للقلب ، وعملت معدلات إنتاج اللاكتات و [13C] البيكربونات اللاحقة على تحديد ، في الوقت الفعلي ، معدلات إنتاج نازعة هيدروجين اللاكتات وبيروفات ديهيدروجيناز. تم قياس هذا النشاط الأيضي لبيروفات فرط الاستقطاب [1-13C] باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي في نموذج بطريقة حرة باستخدام نهج اكتساب الإثارة المشبعة الانتقائية للمنتج. 31 تم تطبيق التحليل الطيفي P بين عمليات الاستحواذ شديدة الاستقطاب لمراقبة طاقة القلب ودرجة الحموضة. هذا النظام مفيد بشكل فريد لدراسة النشاط الأيضي في قلب الفأر الصحي والمريض.

Introduction

ترتبط التغيرات في استقلاب القلب بمجموعة متنوعة من اعتلالات عضلة القلب وغالبا ما تشكل أساس الآليات الفيزيولوجية المرضية الأساسية1. ومع ذلك ، هناك العديد من العقبات التي تحول دون دراسة التمثيل الغذائي في الأنسجة الحية ، حيث تتطلب معظم المقايسات الكيميائية الحيوية تجانس تحلل الأنسجة والخلايا و / أو التتبع الإشعاعي. لذلك ، هناك حاجة ملحة لأدوات جديدة للتحقيق في استقلاب عضلة القلب في الأنسجة الحية. يسمح الرنين المغناطيسي (MR) للركائز ذات العلامات C 13شديدة الاستقطاب بإجراء قياسات في الوقت الفعلي لعملية التمثيل الغذائي في الأنسجة الحية2 ، دون استخدام الإشعاع المؤين ، عن طريق زيادة نسبة إشارة MR إلى الضوضاء (SNR) للموقع (المواقع) المسمى بعدة أوامر من الحجم3. هنا ، نصف الإعداد التجريبي ، ونهج الاستحواذ ، والنهج التحليلي لدراسة التمثيل الغذائي السريع في قلب الفأر المعزول ، وبالتوازي مع ذلك ، نقدم مؤشرات لطاقة الأنسجة العامة والحموضة. يعد الرقم الهيدروجيني للقلب مؤشرا قيما ، حيث يتعطل التوازن الحمضي القاعدي في المراحل المبكرة من أمراض القلب وظروفها مثل نقص تروية عضلة القلب وتضخم غير قادر على التكيف وفشل القلب6.

يساعد إنتاج اللاكتات [1-13 C] lactate و [13 C] بيكربونات من فرط الاستقطاب [1-13C] البيروفات في تحديد معدلات إنتاج نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ونازعة هيدروجين البيروفات (PDH). معظم الدراسات السابقة التي أجريت باستخدام ركائز مفرطة الاستقطاب في قلب القوارض المعزول إما استخدمت نماذج حركية معقدة لاشتقاق النشاط الأنزيمي ل LDH و PDH ، أو أبلغت عن نسب شدة الإشارة للمنتج مفرط الاستقطاب إلى الركيزة دون حساب معدلات نشاط الإنزيم الفعلية2،4،5،6،7،8،9،10 ، 11،12،13،14. هنا ، استخدمنا نهج الإثارة المشبعة الانتقائية للمنتج 15 ، والذي يسمح بمراقبة نشاط الإنزيم بطريقة خالية من النموذج15,16. بهذه الطريقة ، تم تحديد المعدلات الأنزيمية المطلقة (أي عدد مولات المنتج المنتج لكل وحدة زمنية). 31 تم استخدام التحليل الطيفي P لمراقبة إشارات الفوسفات غير العضوي (Pi) والفوسفوكرياتين (PCr) والأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). تم استخدام تحليل متعدد المعلمات لتوصيف توزيع الأس الهيدروجيني للقلب ، كما يتضح من التحول الكيميائي غير المتجانس في إشارة Pi للأنسجة.

قلب الفأر المثقوب بأثر رجعي (قلب Langendorff)17،18،19 هو نموذج خارج الجسم الحي للقلب النابض السليم. في هذا النموذج ، يتم الحفاظ على صلاحية القلب ودرجة الحموضة لمدة 80 دقيقةعلى الأقل 20 ، وقد أظهرت إمكانية الشفاء بعد إصابة إقفارية طويلة21,22. ومع ذلك ، قد يؤدي التباين غير المقصود أثناء الجراحة المجهرية إلى تباين في صلاحية الأنسجة عبر القلوب. وقد ذكرت الدراسات السابقة عن تدهور هذا القلب مع مرور الوقت19; على سبيل المثال ، لوحظ انخفاض في وظيفة انقباض بنسبة 5٪ -10٪ في الساعة18. وقد ثبت سابقا أن إشارة أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) تبلغ عن حالة طاقة عضلة القلب وصلاحيتها23. هنا ، لاحظنا أن القلب المفعم بالإرهاق قد يظهر أحيانا تباينا غير مقصود في مستويات الصلاحية ، كما يتضح من محتوى ATP ، على الرغم من حقيقة أن لدينا نضحا متواصلا وإمدادا بالأكسجين. نوضح هنا أن تطبيع معدلات LDH و PDH لمحتوى ATP للقلب يقلل من التباين بين القلب في هذه المعدلات.

في البروتوكول التالي ، نصف الإجراء الجراحي المستخدم لقنية القلب وعزله وما يترتب على ذلك من تروية في مطياف الرنين المغناطيسي النووي. من الجدير بالذكر أن الأساليب الجراحية الأخرى التي تهدف إلى عزل وتعطير قلب الفأر قد تم وصفها قبل24,25.

كما تم وصف المنهجيات المستخدمة للحصول على البيانات المتعلقة بالمعدلات الأنزيمية في القلب النابض (باستخدام التحليل الطيفي 13 C والبيروفات مفرط الاستقطاب [1-13C]) وصلاحية القلب وحموضته (باستخدام التحليل الطيفي 31P NMR). أخيرا ، يتم شرح المنهجيات التحليلية لتحديد أنشطة الإنزيم الأيضي وصلاحية الأنسجة والحموضة.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات المشتركة (IACUC) في الجامعة العبرية ومركز هداسا الطبي على بروتوكول دراسة الرفق بالحيوان (MD-19-15827-1). 1. إعداد العازلة كريبس هينسليت قبل يوم واحد من التجربة ، قم بإعداد نسخة معدلة من المخزن المؤقت Krebs-Henseleit (KHB)26. في البداية ، قم بإذاب…

Representative Results

يظهر الشكل 1 أ أطياف 31P المسجلة من قلب فأر ممزوج ب KHB ومن المخزن المؤقت وحده. لوحظت إشارات α و β و γ-ATP و PCr و Pi في القلب. تتكون إشارة Pi من مكونين رئيسيين: في المجال الأعلى (الجانب الأيسر من الإشارة) ، كانت إشارة Pi في الغالب بسبب KHB عند درجة حموضة 7.4 ؛ في المجال السفلي (الجانب ا?…

Discussion

نعرض إعدادا تجريبيا مصمما للتحقيق في استقلاب البيروفات المفرط الاستقطاب [1-13C] ، وطاقة الأنسجة ، ودرجة الحموضة في نموذج قلب فأر معزول.

الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول هي كما يلي: 1) التأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت هو 7.4 ؛ 2) التأكد من تضمين جميع مكونات المخزن …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وتلقى هذا المشروع تمويلا من مؤسسة العلوم الإسرائيلية بموجب اتفاق المنحة رقم 1379/18؛ منحة جابوتنسكي من وزارة العلوم والتكنولوجيا الإسرائيلية للعلوم التطبيقية والهندسية لطلاب الدكتوراه المباشرة رقم 3-15892 ل DS ؛ وبرنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Pesquisa do Câncer. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Pesquisa do Câncer. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Hyperpolarized MRICardiac MetabolismIsolated Perfused Mouse HeartPyruvate Metabolism13C/31P NMR SpectroscopyKrebs-Henseleit BufferAerobic And Anaerobic MetabolismCardiac EnergeticsPHLactateInorganic PhosphatePerfusion SystemTemperature Control
check_url/pt/63188?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image