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Biologia

Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie RMN hyperpolarisée [1-13 C]pyruvate et 13C/31P

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Nous décrivons une configuration expérimentale pour administrer des métabolites hyperpolarisés marqués au 13C en mode de perfusion continue à un cœur de souris perfusé isolé. Une approche dédiée d’acquisition de 13C-RMN a permis de quantifier l’activité enzymatique métabolique en temps réel, et une analyse multiparamétrique 31P-RMN a permis de déterminer la teneur en ATP tissulaire et le pH.

Abstract

Le métabolisme est la base de processus importants dans la vie cellulaire. La caractérisation du fonctionnement des réseaux métaboliques dans les tissus vivants fournit des informations cruciales pour comprendre le mécanisme des maladies et concevoir des traitements. Dans ce travail, nous décrivons les procédures et les méthodologies pour étudier l’activité métabolique dans les cellules dans un cœur de souris rétrofusé en temps réel. Le cœur a été isolé in situ, en conjonction avec un arrêt cardiaque pour minimiser l’ischémie myocardique et a été perfusé à l’intérieur d’un spectromètre à résonance magnétique nucléaire (RMN). Dans le spectromètre et sous perfusion continue, du [1-13 C]pyruvate hyperpolarisé a été administré au cœur, et les taux de production de [1-13 C]lactate et de [13C]bicarbonate hyperpolarisés subséquents ont servi à déterminer, en temps réel, les taux de production de lactate déshydrogénase et de pyruvate déshydrogénase. Cette activité métabolique du [1-13C]pyruvate hyperpolarisé a été quantifiée par spectroscopie RMN de manière libre en utilisant l’approche d’acquisition sélective d’excitations saturantes de produits. 31 La spectroscopie P a été appliquée entre les acquisitions hyperpolarisées pour surveiller l’énergétique cardiaque et le pH. Ce système est particulièrement utile pour étudier l’activité métabolique dans le cœur de souris sain et malade.

Introduction

Les altérations du métabolisme cardiaque sont associées à une variété de cardiomyopathies et constituent souvent la base des mécanismes physiopathologiques sous-jacents1. Cependant, il existe de nombreux obstacles à l’étude du métabolisme dans les tissus vivants, car la plupart des tests biochimiques nécessitent l’homogénéisation de la lyse tissulaire et cellulaire et / ou le traçage radioactif. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouveaux outils pour étudier le métabolisme myocardique dans les tissus vivants. La résonance magnétique (RM) de substrats hyperpolarisés marqués au 13C permet de mesurer en temps réel le métabolisme dans les tissus vivants2, sans utiliser de rayonnement ionisant, en augmentant le rapport signal sur bruit (SNR) MR du ou des sites marqués de plusieurs ordres de grandeur3. Ici, nous décrivons une configuration expérimentale, une approche d’acquisition et une approche analytique pour étudier le métabolisme rapide dans le cœur isolé de souris et, en parallèle, présentons des indicateurs de l’énergétique générale des tissus et de l’acidité. Le pH cardiaque est un indicateur précieux, car l’équilibre acido-basique est perturbé dans les premiers stades des maladies cardiaques et des affections telles que l’ischémie myocardique, l’hypertrophie inadaptée et l’insuffisance cardiaque6.

La production hyperpolarisée de [1-13 C]lactate et de [13 C]bicarbonate à partir de [1-13C]pyruvate hyperpolarisé aide à déterminer les taux de production de lactate déshydrogénase (LDH) et de pyruvate déshydrogénase (PDH). La plupart des études précédentes réalisées à l’aide de substrats hyperpolarisés dans le cœur isolé de rongeurs ont soit utilisé des modèles cinétiques complexes pour dériver l’activité enzymatique de la LDH et de la PDH, soit rapporté les rapports d’intensité du signal du produit hyperpolarisé sur un substrat sans calculer les taux d’activité enzymatique réels 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Ici, nous avons utilisé l’approche d’excitation saturante sélective du produit 15, qui permet de surveiller l’activité enzymatique de manière sans modèle15,16. De cette façon, les taux enzymatiques absolus (c’est-à-dire le nombre de moles de produit produites par unité de temps) ont été déterminés. 31 La spectroscopie P a été utilisée pour observer les signaux du phosphate inorganique (Pi), de la phosphocréatine (PCr) et de l’adénosine triphosphate (ATP). Une analyse multiparamétrique a été utilisée pour caractériser la distribution du pH du cœur, comme le démontre le déplacement chimique hétérogène du signal Pi du tissu.

Le cœur de souris rétrofusé (cœur de Langendorff)17,18,19 est un modèle ex vivo pour le cœur battant intact. Dans ce modèle, la viabilité cardiaque et le pH sont préservés pendant au moins 80 minutes20, et il a montré un potentiel de récupération après une lésion ischémique prolongée21,22. Néanmoins, une variabilité involontaire pendant la microchirurgie peut entraîner une variabilité de la viabilité tissulaire entre les cœurs. Des études antérieures ont fait état de la détérioration de ce cœur au fil du temps19; Par exemple, une réduction de la fonction contractile de 5% à 10% par heure a été observée18. Il a déjà été démontré que le signal de l’adénosine triphosphate (ATP) rapportait l’état énergétique et la viabilité du myocarde23. Ici, nous avons noté que le cœur perfusé peut parfois présenter une variabilité involontaire des niveaux de viabilité, comme le démontre la teneur en ATP, malgré le fait que nous avions une perfusion et un apport en oxygène ininterrompus. Nous démontrons ici que la normalisation des taux de LDH et de PDH à la teneur en ATP du cœur réduit la variabilité inter-cardiaque de ces taux.

Dans le protocole suivant, nous décrivons l’intervention chirurgicale utilisée pour la canulation cardiaque, l’isolement et la perfusion consécutive dans le spectromètre RMN. Il convient de noter que d’autres approches chirurgicales visant à isoler et à perfuser le cœur de souris ont été décrites avant24,25.

Les méthodologies utilisées pour acquérir des données relatives aux taux enzymatiques dans le cœur battant (en utilisant la spectroscopie 13 C et le [1-13C]pyruvate hyperpolarisé) et la viabilité et l’acidité du cœur (en utilisant la spectroscopie RMN 31P) sont également décrites. Enfin, les méthodologies analytiques pour déterminer les activités enzymatiques métaboliques et la viabilité et l’acidité des tissus sont expliquées.

Protocol

Le comité mixte d’éthique (IACUC) de l’Université hébraïque et du centre médical Hadassah a approuvé le protocole d’étude pour le bien-être animal (MD-19-15827-1). 1. Préparation du tampon Krebs-Henseleit Un jour avant l’expérience, préparez une version modifiée du tampon Krebs-Henseleit (KHB)26. Dans un premier temps, dissoudre 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 0,5 mM de pyruvate, 1,2 mM de MgSO4, 25 mM deNaHCO3 e…

Representative Results

Les spectres 31P enregistrés à partir d’un cœur de souris perfusé avec du KHB et du tampon seul sont représentés à la figure 1A. Les signaux de α, β et γ-ATP, PCr et Pi ont été observés dans le cœur. Le signal Pi était composé de deux composantes principales: dans le champ supérieur (côté gauche du signal), le signal Pi était principalement dû au KHB à un pH de 7,4; dans le champ inférieur (côté droit du signal), le signal Pi était plus large et moins h…

Discussion

Nous démontrons une configuration expérimentale conçue pour étudier le métabolisme hyperpolarisé du [1-13C]pyruvate, l’énergétique tissulaire et le pH dans un modèle cardiaque de souris isolé.

Les étapes critiques du protocole sont les suivantes : 1) s’assurer que le pH du tampon est de 7,4; 2) s’assurer que tous les composants du tampon sont inclus; 3) éviter la coagulation du sang dans les vaisseaux cardiaques par injections d’héparine; 4) éviter les dommages…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a reçu un financement de la Fondation israélienne pour la science en vertu de la convention de subvention n° 1379/18; la bourse Jabotinsky du ministère israélien de la Science et de la Technologie pour les sciences appliquées et les sciences de l’ingénieur pour les doctorants directs n ° 3-15892 pour D.S.; et le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
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Referências

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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
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