JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau zur Verabreichung von hyperpolarisierten 13C-markierten Metaboliten im kontinuierlichen Perfusionsmodus an ein isoliertes perfundiertes Mausherz. Ein spezieller 13-C-NMR-Erfassungsansatz ermöglichte die Quantifizierung der metabolischen Enzymaktivität in Echtzeit, und eine multiparametrische 31-P-NMR-Analyseermöglichte die Bestimmung des ATP-Gehalts und des pH-Werts des Gewebes.

Abstract

Der Stoffwechsel ist die Grundlage wichtiger Prozesse im zellulären Leben. Die Charakterisierung der Funktionsweise von Stoffwechselnetzwerken in lebenden Geweben liefert entscheidende Informationen für das Verständnis der Mechanismen von Krankheiten und die Entwicklung von Behandlungen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren und Methoden zur Untersuchung der zellinternen Stoffwechselaktivität in einem retrograden perfundierten Mausherz in Echtzeit. Das Herz wurde in situ isoliert, in Verbindung mit einem Herzstillstand, um die Myokardischämie zu minimieren, und wurde in einem Kernspinresonanzspektrometer (NMR) perfundiert. Während des Spektrometers und unter kontinuierlicher Perfusion wurde dem Herzen hyperpolarisiertes [1-13 C]pyruvat verabreicht, und die anschließenden hyperpolarisierten [1-13 C]Laktat- und [13C]Bicarbonat-Produktionsraten dienten dazu, in Echtzeit die Raten der Laktatdehydrogenase- und Pyruvatdehydrogenase-Produktion zu bestimmen. Diese metabolische Aktivität von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat wurde mit NMR-Spektroskopie modellfrei unter Verwendung des produktselektiven Ansatzes zur Erfassung von Sättigungsanregungen quantifiziert. 31 Die P-Spektroskopie wurde zwischen den hyperpolarisierten Aufnahmen angewendet, um die Herzenergetik und den pH-Wert zu überwachen. Dieses System ist einzigartig nützlich für die Untersuchung der Stoffwechselaktivität im gesunden und kranken Mausherzen.

Introduction

Veränderungen des Herzstoffwechsels sind mit einer Vielzahl von Kardiomyopathien assoziiert und bilden häufig die Grundlage für die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen1. Es gibt jedoch zahlreiche Hindernisse bei der Untersuchung des Stoffwechsels in lebenden Geweben, da die meisten biochemischen Assays die Homogenisierung des Gewebes und die Zelllyse und/oder die radioaktive Rückverfolgung erfordern. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Werkzeugen zur Untersuchung des Myokardstoffwechsels in lebenden Geweben. Die Magnetresonanz (MR) von hyperpolarisierten 13C-markierten Substraten ermöglicht Echtzeitmessungen des Stoffwechsels in lebenden Geweben2 ohne den Einsatz ionisierender Strahlung, indem das MR-Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der markierten Stelle(n) um mehrere Größenordnungenerhöht wird 3. Hier beschreiben wir einen Versuchsaufbau, einen Erfassungsansatz und einen analytischen Ansatz zur Untersuchung des schnellen Stoffwechsels im isolierten Mausherz und präsentieren parallel dazu Indikatoren für die allgemeine Gewebeenergetik und den Säuregehalt. Der pH-Wert des Herzens ist ein wertvoller Indikator, da das Säure-Basen-Gleichgewicht in den frühen Stadien von Herzerkrankungen und Zuständen wie Myokardischämie, maladaptiver Hypertrophie und Herzinsuffizienz gestört ist6.

Die hyperpolarisierte Produktion von [1-13 C]lactat und [13 C]Bicarbonat aus hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat hilft bei der Bestimmung der Produktionsraten von Laktatdehydrogenase (LDH) und Pyruvatdehydrogenase (PDH). Die meisten der früheren Studien, die unter Verwendung hyperpolarisierter Substrate im isolierten Nagetierherz durchgeführt wurden, verwendeten entweder komplexe kinetische Modelle, um die enzymatische Aktivität von LDH und PDH abzuleiten, oder berichteten über die Signalintensitätsverhältnisse des hyperpolarisierten Produkts zu einem Substrat, ohne die tatsächlichen Enzymaktivitätsraten zu berechnen 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Hier haben wir den produktselektiven Sättigungsanregungsansatz 15 verwendet, der es ermöglicht, die Enzymaktivität modellfrei zu überwachen15,16. Auf diese Weise wurden die absoluten enzymatischen Raten (d.h. die Anzahl der Mol des pro Zeiteinheit produzierten Produkts) bestimmt. 31 Die P-Spektroskopie wurde verwendet, um die Signale von anorganischem Phosphat (Pi), Phosphokreatin (PCr) und Adenosintriphosphat (ATP) zu beobachten. Eine multiparametrische Analyse wurde verwendet, um die pH-Verteilung des Herzens zu charakterisieren, wie die heterogene chemische Verschiebung des Pi-Signals des Gewebes zeigt.

Das retrograd durchblutete Mausherz (Langendorff-Herz)17,18,19 ist ein Ex-vivo-Modell für das intakt schlagende Herz. In diesem Modell bleiben die Lebensfähigkeit des Herzens und der pH-Wert für mindestens 80 Minutenerhalten 20 und es hat sich ein Erholungspotenzial nach einer längeren ischämischen Verletzung gezeigt21,22. Nichtsdestotrotz kann eine unbeabsichtigte Variabilität während der Mikrochirurgie zu einer Variabilität der Gewebelebensfähigkeit zwischen den Herzen führen. Frühere Studien haben über die Verschlechterung dieses Herzens im Laufe der Zeit berichtet19; Zum Beispiel wurde eine Verringerung der kontraktilen Funktion von 5%-10% pro Stunde beobachtet18. Es wurde bereits gezeigt, dass das Adenosintriphosphat (ATP)-Signal über den energetischen Status und die Lebensfähigkeit des Myokards berichtet23. Hier stellten wir fest, dass das perfundierte Herz gelegentlich eine unbeabsichtigte Variabilität der Lebensfähigkeit aufweisen kann, wie der ATP-Gehalt zeigt, obwohl wir eine ununterbrochene Perfusion und Sauerstoffversorgung hatten. Wir zeigen hier, dass die Normalisierung der LDH- und PDH-Raten auf den ATP-Gehalt des Herzens die Inter-Herz-Variabilität in diesen Raten reduziert.

Im folgenden Protokoll beschreiben wir den chirurgischen Eingriff zur Herzkanülierung, Isolierung und anschließenden Perfusion im NMR-Spektrometer. Bemerkenswert ist, dass andere chirurgische Ansätze, die darauf abzielen, das Mausherz zu isolieren und zu perfundieren, vor24,25 beschrieben wurden.

Die Methoden zur Erfassung von Daten in Bezug auf die enzymatischen Raten im schlagenden Herzen (unter Verwendung von 13 C-Spektroskopie und hyperpolarisiertem [1-13C] Pyruvat) sowie die Lebensfähigkeit und den Säuregehalt des Herzens (unter Verwendung der 31P-NMR-Spektroskopie) werden ebenfalls beschrieben. Abschließend werden die analytischen Methoden zur Bestimmung der metabolischen Enzymaktivitäten sowie der Lebensfähigkeit und des Säuregehalts des Gewebes erläutert.

Protocol

Die gemeinsame Ethikkommission (IACUC) der Hebräischen Universität und des Hadassah Medical Center hat das Studienprotokoll für den Tierschutz (MD-19-15827-1) genehmigt. 1. Krebs-Henseleit-Pufferpräparation Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment eine modifizierte Version des Krebs-Henseleit-Puffers (KHB) vor26. Zunächst werden 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM Pyruvat, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 und 1,2 mM KH2 …

Representative Results

Die 31P-Spektren, die von einem mit KHB perfundierten Mausherz und nur vom Puffer aufgenommen wurden, sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Signale von α-, β- und γ-ATP, PCr und Pi wurden im Herzen beobachtet. Das Pi-Signal setzte sich aus zwei Hauptkomponenten zusammen: Im höheren Feld (linke Seite des Signals) war das Pi-Signal hauptsächlich auf die KHB bei einem pH-Wert von 7,4 zurückzuführen; Im unteren Feld (rechte Seite des Signals) war das Pi-Signal aufgrund der saur…

Discussion

Wir demonstrieren einen experimentellen Aufbau, der darauf ausgelegt ist, den hyperpolarisierten [1-13C]Pyruvatstoffwechsel, die Gewebeenergetik und den pH-Wert in einem isolierten Mausherzmodell zu untersuchen.

Die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls sind wie folgt: 1) Sicherstellen, dass der pH-Wert des Puffers 7,4 beträgt; 2) Sicherstellung, dass alle Komponenten des Puffers enthalten sind; 3) Vermeidung der Blutgerinnung in den Herzgefäßen durch Heparin-Injektionen; …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wurde von der Israel Science Foundation im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 1379/18 finanziert; das Jabotinsky-Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie für angewandte und ingenieurwissenschaftliche Wissenschaften für direkte Doktoranden Nr. 3-15892 für D.S.; und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Pesquisa do Câncer. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Pesquisa do Câncer. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Hyperpolarized MRICardiac MetabolismIsolated Perfused Mouse HeartPyruvate Metabolism13C/31P NMR SpectroscopyKrebs-Henseleit BufferAerobic And Anaerobic MetabolismCardiac EnergeticsPHLactateInorganic PhosphatePerfusion SystemTemperature Control
check_url/pt/63188?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image