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Biologia

単離灌流マウス心臓における過分極[1-13 C]ピルビン酸および13C/31P NMR分光法による心臓代謝の調査(英語)

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

過分極した 13C標識代謝物を連続灌流モードで単離灌流マウス心臓に投与するための実験セットアップについて説明します。専用の 13C-NMR取得アプローチにより、代謝酵素活性をリアルタイムで定量でき、マルチパラメトリック 31P-NMR分析により、組織のATP含有量とpHを測定できました。

Abstract

代謝は細胞生活における重要なプロセスの基礎です。生体組織における代謝ネットワークの機能を評価することは、疾患のメカニズムを理解し、治療法を設計するための重要な情報を提供します。この研究では、逆行性灌流マウス心臓の細胞内代謝活動をリアルタイムで研究するための手順と方法論について説明します。心臓は、心筋虚血を最小限に抑えるために心停止と併せてその場で単離され、核磁気共鳴(NMR)分光計内で灌流されました。分光計内および連続灌流下で、過分極[1-13 C]ピルビン酸を心臓に投与し、その後の過分極[1-13C]乳酸および[13C]重炭酸塩産生速度は、乳酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼ産生の速度をリアルタイムで決定するのに役立ちました。この過分極[1-13C]ピルビン酸の代謝活性は、生成物選択的飽和励起獲得法を用いて、モデルフリー方式でNMR分光法で定量されました。31名P分光法は、心臓エネルギーとpHを監視するために、過分極取得の間に適用されました。このシステムは、健康なマウスと病気のマウスの心臓の代謝活性を研究するのにユニークに有用です。

Introduction

心臓代謝の変化は、さまざまな心筋症に関連しており、多くの場合、根底にある病態生理学的メカニズムの基礎を形成します1。しかし、ほとんどの生化学的アッセイでは組織の均質化と細胞溶解および/または放射性トレースが必要であるため、生体組織の代謝を研究するには多くの障害があります。したがって、生体組織における心筋代謝を調べるための新しいツールが急務となっています。過分極した 13C標識基質の磁気共鳴(MR)は、標識部位のMR信号対雑音比(SNR)を数桁3増加させることにより、電離放射線を使用せずに生体組織2の代謝のリアルタイム測定を可能にします。ここでは、単離されたマウス心臓の急速な代謝を研究するための実験セットアップ、獲得アプローチ、および分析アプローチについて説明し、並行して、一般的な組織エネルギーと酸性度の指標を提示します。心筋虚血、不適応肥大、心不全などの心臓病や状態の初期段階では酸塩基バランスが崩れるため、心臓のpHは貴重な指標です6。

過分極[1-13 C]ピルビン酸からの過分極[1-13C]乳酸および[13C]重炭酸塩の生産は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)の産生速度を決定するのに役立ちます。単離されたげっ歯類の心臓で過分極基質を使用して行われた以前の研究のほとんどは、複雑な速度論モデルを使用してLDHとPDHの酵素活性を導き出すか、実際の酵素活性率を計算せずに過分極産物の基質に対するシグナル強度比を報告しました2,4,5,6,7,8,9,10、11,12,13,14。ここでは、モデルフリー様式での酵素活性のモニタリングを可能にする生成物選択的飽和励起アプローチ15、16を用いた。このようにして、絶対酵素速度(すなわち、単位時間当たりに生産される生成物のモル数)を決定した。31名P分光法を利用して、無機リン酸(Pi)、ホスホクレアチン(PCr)、およびアデノシン三リン酸(ATP)のシグナルを観察しました。マルチパラメトリック分析を使用して、組織のPi信号の不均一な化学シフトによって実証されるように、心臓のpH分布を特徴付けました。

逆行性灌流マウス心臓(Langendorff heart)17,18,19は、無傷の拍動心臓のex vivoモデルです。このモデルでは、心臓の生存率とpHは少なくとも80分間保存され20、長期の虚血性損傷後の回復の可能性を示しています21,22。それにもかかわらず、顕微手術中の不注意な変動は、心臓全体の組織生存率の変動につながる可能性があります。以前の研究では、この心臓の経時的な劣化が報告されています19。例えば、1時間当たり5%〜10%の収縮機能の低下が観察されている18。アデノシン三リン酸(ATP)シグナルは、心筋のエネルギー状態および生存率について報告することが以前に示されている23。ここでは、灌流された心臓は、ATP含有量によって示されるように、中断のない灌流と酸素供給があったにもかかわらず、生存率レベルに意図しない変動を示すことがあることに注意しました。ここでは、LDHおよびPDH率を心臓のATP含有量に正規化すると、これらの率の心臓間変動が減少することを示しています。

以下のプロトコルでは、NMR分光計での心臓カニュレーション、分離、およびその結果としての灌流に使用される外科的処置について説明します。注目すべきことに、マウス心臓を単離し灌流することを目的とした他の外科的アプローチは、24,25より前に記載されている。

鼓動する心臓の酵素速度(13 C分光法と過分極[1-13C]ピルビン酸を使用)および心臓の生存率と酸性度(31P NMR分光法を使用)に関連するデータを取得するために使用される方法論についても説明します。最後に、代謝酵素活性と組織の生存率と酸性度を決定するための分析方法論について説明します。

Protocol

ヘブライ大学とハダサ医療センターの合同倫理委員会(IACUC)は、動物福祉の研究プロトコル(MD-19-15827-1)を承認しました。 1. クレブス・ヘンゼライトバッファー調製 実験の前日に、クレブスヘンゼライトバッファー(KHB)26の修正バージョンを準備します。最初に、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、0.5 mM ピルビン酸、1.2 mM MgSO 4、25 mM NaHCO3、お?…

Representative Results

KHBを灌流したマウス心臓およびバッファーのみから記録した 31Pスペクトルを 図1Aに示します。α、β、およびγ ATP、PCr、およびPiのシグナルが心臓で観察されました。Pi信号は2つの主要な成分で構成されていました:より高いフィールド(信号の左側)では、Pi信号は主にpH7.4のKHBによるものでした。下のフィールド(信号の右側)では、Pi信号はより酸性の環境のため?…

Discussion

分離されたマウス心臓モデルで過分極[1-13C]ピルビン酸代謝、組織エネルギー、およびpHを調査するように設計された実験セットアップを示します。

プロトコル内の重要なステップは次のとおりです:1)バッファーのpHが7.4であることを確認する。2)バッファのすべてのコンポーネントが含まれていることを確認する。3)ヘパリン注射による心臓血管内の血液凝固の回…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、助成金契約番号1379/18に基づいてイスラエル科学財団から資金提供を受けました。イスラエル科学技術省の応用工学科学省のジャボチンスキー奨学金は、D.S.の直接博士課程の学生番号3-15892です。助成金契約第858149号(AlternativesToGd)に基づく欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラム。

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
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Referências

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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
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