Undersøkelse av hjertemetabolisme i isolert perfusert musehjerte med hyperpolarisert [1-13 C]pyruvat og 13C/31P NMR-spektroskopi

Summary

Vi beskriver et eksperimentelt oppsett for administrering av hyperpolariserte ¹³C-merkede metabolitter i kontinuerlig perfusjonsmodus til et isolert perfusert musehjerte. En dedikert ¹³C-NMR-oppkjøpsmetode muliggjorde kvantifisering av metabolsk enzymaktivitet i sanntid, og en multiparametrisk ³¹P-NMR-analyse muliggjorde bestemmelse av vevets ATP-innhold og pH.

Abstract

Metabolisme er grunnlaget for viktige prosesser i cellulært liv. Karakterisering av hvordan metabolske nettverk fungerer i levende vev gir viktig informasjon for å forstå sykdomsmekanismen og utforme behandlinger. I dette arbeidet beskriver vi prosedyrer og metoder for å studere metabolsk aktivitet i celler i et retrograd perfusert musehjerte i sanntid. Hjertet ble isolert in situ i forbindelse med hjertestans for å minimere myokardiskemien og ble perfundert inne i et NMR-spektrometer (kjernemagnetisk resonans). Mens i spektrometeret og under kontinuerlig perfusjon ble hyperpolarisert [1-13 C] pyruvat administrert til hjertet, og de påfølgende hyperpolariserte [1-13 C] laktat- og [¹³C] bikarbonatproduksjonshastighetene tjente til å bestemme, i sanntid, hastighetene av laktatdehydrogenase og pyruvat dehydrogenaseproduksjon. Denne metabolske aktiviteten til hyperpolarisert [^1-13C]pyruvat ble kvantifisert med NMR-spektroskopi på en modellfri måte ved bruk av produktselektiv metting-eksitasjoner oppkjøpsmetode. ³¹ P-spektroskopi ble brukt mellom de hyperpolariserte oppkjøpene for å overvåke hjerteenergien og pH. Dette systemet er unikt nyttig for å studere metabolsk aktivitet i det sunne og syke musehjertet.

Introduction

Endringer i hjertemetabolismen er forbundet med en rekke kardiomyopatier og danner ofte grunnlaget for de underliggende patofysiologiske mekanismene¹. Imidlertid er det mange hindringer for å studere metabolisme i levende vev, da de fleste biokjemiske analyser krever homogenisering av vev og cellelyse og / eller radioaktiv sporing. Derfor er det et presserende behov for nye verktøy for å undersøke myokardmetabolisme i levende vev. Magnetisk resonans (MR) av hyperpolariserte ¹³C-merkede substrater muliggjør sanntidsmålinger av metabolisme i levende vev², uten bruk av ioniserende stråling, ved å øke MR-signal-til-støy-forholdet (SNR) til det merkede stedet (e) med flere størrelsesordener³. Her beskriver vi et eksperimentelt oppsett, en oppkjøpsmetode og en analytisk tilnærming for å studere den raske metabolismen i det isolerte musehjertet og parallelt presentere indikatorer for generell vevsenergi og surhet. Hjertets pH er en verdifull indikator, da syrebasebalansen forstyrres i de tidlige stadier av hjertesykdommer og tilstander som myokardiskemi, maladaptiv hypertrofi og hjertesvikt⁶.

Hyperpolarisert [1-13 C] laktat og [13 C] bikarbonat produksjon fra hyperpolarisert [^1-13C] pyruvat bidrar til å bestemme produksjonshastighetene av laktat dehydrogenase (LDH) og pyruvat dehydrogenase (PDH). De fleste av de tidligere studiene utført ved bruk av hyperpolariserte substrater i det isolerte gnagerhjertet brukte enten komplekse kinetiske modeller for å utlede den enzymatiske aktiviteten til LDH og PDH, eller rapporterte signalintensitetsforholdene til det hyperpolariserte produktet til et substrat uten å beregne de faktiske enzymaktivitetshastighetene 2,4,5,6,7,8,9,10^{, 11,12,13,14}. Her brukte vi produktselektiv saturating-excitations tilnærming 15, som muliggjør overvåking av enzymaktiviteten på en modellfri måte^15,16. På denne måten ble de absolutte enzymatiske hastighetene (dvs. antall mol produkt produsert per tidsenhet) bestemt. ³¹ P-spektroskopi ble brukt til å observere signalene fra uorganisk fosfat (Pi), fosfokreatin (PCr) og adenosintrifosfat (ATP). En multiparametrisk analyse ble brukt til å karakterisere pH-fordelingen i hjertet, som demonstrert av det heterogene kjemiske skiftet i vevets Pi-signal.

Det retrograd perfuserte musehjertet (Langendorffhjertet)^17,18,19 er en ex vivo-modell for det intakte bankende hjertet. I denne modellen er hjertets levedyktighet og pH bevart i minst 80 min²⁰, og det har vist potensial for utvinning etter en langvarig iskemisk skade^21,22. Likevel kan utilsiktet variabilitet under mikrokirurgi føre til variasjon i vevets levedyktighet på tvers av hjerter. Tidligere studier har rapportert om forverring av dette hjertet over tid¹⁹; For eksempel er det observert en reduksjon i kontraktil funksjon på 5%-10% per time¹⁸. Adenosintrifosfatsignalet (ATP) har tidligere vist seg å rapportere om myokardial energisk status og levedyktighet²³. Her bemerket vi at det perfuserte hjertet noen ganger kan vise utilsiktet variasjon i levedyktighetsnivåer, som demonstrert av ATP-innholdet, til tross for at vi hadde en uavbrutt perfusjons- og oksygenforsyning. Vi demonstrerer her at normalisering av LDH- og PDH-ratene til ATP-innholdet i hjertet reduserer interhjertevariabiliteten i disse hastighetene.

I den følgende protokollen beskriver vi den kirurgiske prosedyren som brukes ved hjertekanylering, isolering og påfølgende perfusjon i NMR-spektrometeret. Det er verdt å merke seg at andre kirurgiske tilnærminger rettet mot å isolere og perfisere musehjertet har blitt beskrevet før^24,25.

Metodene som brukes for å skaffe data relatert til enzymatiske hastigheter i det bankende hjertet (ved bruk av 13 C-spektroskopi og hyperpolarisert [^1-13C] pyruvat) og hjertets levedyktighet og surhet (ved bruk av ³¹P NMR-spektroskopi) er også beskrevet. Til slutt forklares de analytiske metodene for å bestemme metabolske enzymaktiviteter og vevets levedyktighet og surhet.

Protocol

Den felles etiske komiteen (IACUC) ved Det hebraiske universitetet og Hadassah Medical Center godkjente studieprotokollen for dyrevelferd (MD-19-15827-1). 1. Krebs-Henseleit buffer forberedelse En dag før forsøket, lag en modifisert versjon av Krebs-Henseleit-bufferen (KHB) 26. Oppløs i utgangspunktet 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM pyruvat, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 og 1,2 mM KH 2 PO4 i dobbeltdestillert H2</su…

Representative Results

31P-spektrene registrert fra et musehjerte perfusert med KHB og fra bufferen alene er vist i figur 1A. Signalene fra α-, β- og γ-ATP, PCr og Pi ble observert i hjertet. Pi-signalet var sammensatt av to hovedkomponenter: i det høyere feltet (venstre side av signalet) skyldtes Pi-signalet hovedsakelig KHB ved en pH på 7,4; i det nedre feltet (høyre side av signalet) var Pi-signalet bredere og mindre homogent på grunn av det surere miljøet. Sistnevnte mønster oppstår fra hj…

Discussion

Vi demonstrerer et eksperimentelt oppsett som er designet for å undersøke hyperpolarisert [^1-13C] pyruvat metabolisme, vevsenergi og pH i en isolert musehjertemodell.

De kritiske trinnene i protokollen er som følger: 1) sikre at bufferens pH er 7,4; 2) sikre at alle komponentene i bufferen er inkludert; 3) unngå blodpropp i hjertekarene ved heparininjeksjoner; 4) unngå iskemisk skade på hjertet ved å redusere metabolsk aktivitet (KCl injeksjon og iskald buffer); 5) unngå inn…

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments	52-ZNP91000	HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer	RS2D		NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump	Cole-Parmer	07554-95
Temperature probe	Osensa	FTX-100-LUX+	NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes	Cole-Parmer	HV-96119-16	L/S 16 I.D. 3.1 mm
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines	Upchurch Scientific		id. 0.040”
Intravenous catheter	BD Medical	381323	22 G
Silk suture	Ethicon	W577H	Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-8077-1
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074	CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	CAS: 50-99-77
Heparin sodium	Rotexmedica	HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37%	Sigma-Aldrich	258148	CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog)	Novo Nordisk
Isoflurane	Terrel
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	793612	CAS: 7487-88-9
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate	Gadot Group		CAS: 144-55-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	655104	CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S7907	CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate	Merck	6345	CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade)	Amresco	0826	CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063	GE Healthcare AS	NC100136	OX063
NMR standards
13C standard sample	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-72A	40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample	Made in house		105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016	Microsoft
MNova	Mestrelab Research