Исследование сердечного метаболизма в изолированном перфузированном сердце мыши с помощью гиперполяризованной [1-13 C] пируватной и 13C/31P ЯМР-спектроскопии
Summary
Мы описываем экспериментальную установку для введения гиперполяризованных 13-меченных 13С-метаболитов в режиме непрерывной перфузии изолированному перфузированному сердцу мыши. Специальный подход к сбору данных 13С-ЯМР позволил количественно оценить активность метаболических ферментов в режиме реального времени, а многопараметрический анализ 31Р-ЯМР позволил определить содержание АТФ в ткани и рН.
Abstract
Обмен веществ является основой важных процессов в клеточной жизни. Характеристика того, как функционируют метаболические сети в живых тканях, дает важную информацию для понимания механизма заболеваний и разработки методов лечения. В данной работе мы описываем процедуры и методики изучения внутриклеточной метаболической активности в ретроградно перфузированном сердце мыши в режиме реального времени. Сердце было изолировано in situ в сочетании с остановкой сердца, чтобы свести к минимуму ишемию миокарда, и перфузировалось внутри спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В то время как в спектрометре и при непрерывной перфузии гиперполяризованный [1-13 C] пируват вводили в сердце, а последующие гиперполяризованные [1-13 C] лактат и [13C] бикарбонат служили для определения в режиме реального времени скорости производства лактатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Эта метаболическая активность гиперполяризованного [1-13C]пирувата была количественно определена с помощью ЯМР-спектроскопии в свободной модели с использованием метода получения селективного насыщения-возбуждения продукта. 31 См. В промежутках между гиперполяризованными исследованиями применялась P-спектроскопия для мониторинга сердечной энергетики и рН. Эта система уникально полезна для изучения метаболической активности в здоровом и больном сердце мыши.
Introduction
Изменения в сердечном метаболизме связаны с различными кардиомиопатиями и часто составляют основу основных патофизиологических механизмов1. Тем не менее, существует множество препятствий для изучения метаболизма в живых тканях, поскольку большинство биохимических анализов требуют гомогенизации ткани и лизиса клеток и/или радиоактивного отслеживания. Поэтому существует острая потребность в новых инструментах для исследования метаболизма миокарда в живых тканях. Магнитный резонанс (МРТ) гиперполяризованных 13С-меченных субстратов позволяет в режиме реального времени измерять метаболизм в живых тканях2 без использования ионизирующего излучения путем увеличения отношения сигнал/шум МР-сигнал/шум (SNR) меченого сайта (сайтов) на несколько порядков3. Здесь мы описываем экспериментальную установку, подход к приобретению и аналитический подход для изучения быстрого метаболизма в изолированном сердце мыши и, параллельно, представляем показатели общей тканевой энергетики и кислотности. рН сердца является ценным показателем, так как кислотно-щелочной баланс нарушается на ранних стадиях сердечных заболеваний и таких состояний, как ишемия миокарда, дезадаптивная гипертрофия исердечная недостаточность6.
Гиперполяризованное производство [1-13 C]лактата и [13 C]бикарбоната из гиперполяризованного [1-13C] пирувата помогает определить скорость производства лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и пируватдегидрогеназы (ПДГ). В большинстве предыдущих исследований, выполненных с использованием гиперполяризованных субстратов в изолированном сердце грызуна, либо использовались сложные кинетические модели для получения ферментативной активности ЛДГ и ФДГ, либо сообщалось об отношениях интенсивности сигнала гиперполяризованного продукта к субстрату без расчета фактических скоростей активности ферментов 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Здесь мы использовали метод 15 селективного насыщения-возбуждения продукта, который позволяет контролировать активность фермента без моделирования15,16. Таким образом, были определены абсолютные ферментативные скорости (т.е. количество молей продукта, произведенного в единицу времени). 31 См. P-спектроскопия использовалась для наблюдения сигналов неорганического фосфата (Pi), фосфокреатина (PCr) и аденозинтрифосфата (АТФ). Многопараметрический анализ был использован для характеристики распределения рН сердца, о чем свидетельствует гетерогенный химический сдвиг в Pi-сигнале ткани.
Ретроградно перфузированное сердце мыши (сердце Лангендорфа)17,18,19 является моделью ex vivo для неповрежденного бьющегося сердца. В этой модели жизнеспособность сердца и рН сохраняются в течение не менее 80 мин20, и она показала потенциал для восстановления после длительного ишемического повреждения21,22. Тем не менее, непреднамеренная вариабельность во время микрохирургии может привести к вариабельности жизнеспособности тканей в сердцах. В предыдущих исследованиях сообщалось об ухудшении состояния этого сердца с течением времени19; Например, наблюдалось снижение сократительной функции на 5-10% в час18. Ранее было показано, что сигнал аденозинтрифосфата (АТФ) сообщает об энергетическом статусе и жизнеспособности миокарда23. Здесь мы отметили, что перфузированное сердце может иногда демонстрировать непреднамеренную вариабельность уровней жизнеспособности, о чем свидетельствует содержание АТФ, несмотря на то, что у нас была непрерывная перфузия и снабжение кислородом. Здесь мы демонстрируем, что нормализация показателей ЛДГ и ФДГ к содержанию АТФ в сердце снижает межсердечную вариабельность этих показателей.
В следующем протоколе мы описываем хирургическую процедуру, используемую для канюляции сердца, выделения и последующей перфузии в ЯМР-спектрометре. Следует отметить, что другие хирургические подходы, направленные на изоляцию и перфузию сердца мыши, были описаны до24,25.
Также описаны методики, используемые для получения данных, связанных с ферментативными скоростями в работающем сердце (с использованием спектроскопии 13 C и гиперполяризованного [1-13C] пирувата), а также жизнеспособностью и кислотностью сердца (с использованием 31P ЯМР-спектроскопии). Наконец, объясняются аналитические методологии определения активности метаболических ферментов, жизнеспособности и кислотности тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы демонстрируем экспериментальную установку, предназначенную для исследования гиперполяризованного [1-13C] пируватного метаболизма, тканевой энергетики и рН в изолированной модели сердца мыши.
Важнейшими шагами в рамках протокола являются следующие: 1) обеспечени…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался Израильским научным фондом в рамках грантового соглашения No 1379/18; стипендия Жаботинского Министерства науки и технологий Израиля по прикладным и инженерным наукам для прямых аспирантов No 3-15892 для докторов наук; и исследовательская и инновационная программа Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 858149 (AlternativesToGd).
Materials
| Equipment | |||
| HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer |
| NMR spectrometer | RS2D | NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 07554-95 | |
| Temperature probe | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR compatible temprature probe |
| Somnosuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | ||
| Lines, tubings, suture | |||
| Platinum cured silicone tubes | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm |
| Thin polyether ether ketone (PEEK) lines | Upchurch Scientific | id. 0.040” | |
| Intravenous catheter | BD Medical | 381323 | 22 G |
| Silk suture | Ethicon | W577H | Wire diameter of 3-0 |
| Chemicals and pharmaceuticals | |||
| [1-13C]pyruvic acid | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | CAS: 10043-52-4 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | CAS: 50-99-77 |
| Heparin sodium | Rotexmedica | HEP5A0130C0160 | |
| Hydrochloric acid 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
| Insulin aspart (NovoLog) | Novo Nordisk | ||
| Isoflurane | Terrel | ||
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 793612 | CAS: 7487-88-9 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | CAS: 7447-40-7 |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | CAS: 7778-77-0 |
| Sodium bicarbonate | Gadot Group | CAS: 144-55-8 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | CAS: 7647-14-5 |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 655104 | CAS: 1310-73-2 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | CAS: 7558-79-4 |
| Sodium phosphate monbasic dihydrate | Merck | 6345 | CAS: 13472-35-0 |
| TRIS (biotechnology grade) | Amresco | 0826 | CAS: 77-86-1 |
| Trityl radical OX063 | GE Healthcare AS | NC100136 | OX063 |
| NMR standards | |||
| 13C standard sample | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 40% p-dioxane in benzene-D6 |
| 31P standard sample | Made in house | 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O | |
| Software | |||
| Excel 2016 | Microsoft | ||
| MNova | Mestrelab Research |
Referências
- Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
- Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
- Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
- Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
- Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
- Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
- Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
- Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
- Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
- Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
- Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
- Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
- Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
- Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
- Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
- Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
- Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
- Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
- Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
- Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
- Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
- Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
- Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
- Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
- Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Pesquisa do Câncer. 7 (15), 4616-4628 (2013).
- Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
- Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
- Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
- Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Pesquisa do Câncer. 78 (14), 3755-3760 (2018).
- Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
- Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
- Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
- Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
- Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
- Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).
