Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopia de RMN 13C / 31P

Summary

Describimos una configuración experimental para administrar metabolitos hiperpolarizados marcados con ¹³C en modo de perfusión continua a un corazón de ratón perfundido aislado. Un enfoque dedicado de adquisición de ¹³C-RMN permitió la cuantificación de la actividad enzimática metabólica en tiempo real, y un análisis multiparamétrico de ³¹R-P permitió la determinación del contenido de ATP tisular y el pH.

Abstract

El metabolismo es la base de procesos importantes en la vida celular. La caracterización de cómo funcionan las redes metabólicas en los tejidos vivos proporciona información crucial para comprender el mecanismo de las enfermedades y diseñar tratamientos. En este trabajo, describimos procedimientos y metodologías para estudiar la actividad metabólica en la célula en un corazón de ratón retrógradamente perfundido en tiempo real. El corazón se aisló in situ, junto con un paro cardíaco para minimizar la isquemia miocárdica y se perfundió dentro de un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN). Mientras estaba en el espectrómetro y bajo perfusión continua, se administró piruvato hiperpolarizado [1-13 C] al corazón, y las posteriores tasas de producción hiperpolarizadas de [1-13 C] lactato y [¹³C] bicarbonato sirvieron para determinar, en tiempo real, las tasas de producción de lactato deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa. Esta actividad metabólica del piruvato hiperpolarizado [^1-13C] se cuantificó con espectroscopia de RMN en un modelo de manera libre utilizando el enfoque de adquisición de excitaciones de saturación selectivas del producto. ³¹ La espectroscopia P se aplicó entre las adquisiciones hiperpolarizadas para monitorear la energética cardíaca y el pH. Este sistema es excepcionalmente útil para estudiar la actividad metabólica en el corazón sano y enfermo del ratón.

Introduction

Las alteraciones en el metabolismo cardíaco están asociadas con una variedad de miocardiopatías y a menudo forman la base de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes¹. Sin embargo, existen numerosos obstáculos para estudiar el metabolismo en tejidos vivos, ya que la mayoría de los ensayos bioquímicos requieren la homogeneización de la lisis tisular y celular y / o el trazado radiactivo. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de nuevas herramientas para investigar el metabolismo miocárdico en tejidos vivos. La resonancia magnética (RM) de sustratos hiperpolarizados marcados con ¹³C permite mediciones en tiempo real del metabolismo en tejidos vivos², sin el uso de radiación ionizante, al aumentar la relación señal-ruido (SNR) de MR del sitio (s) marcado en varios órdenes de magnitud³. Aquí, describimos una configuración experimental, un enfoque de adquisición y un enfoque analítico para estudiar el metabolismo rápido en el corazón de ratón aislado y, en paralelo, presentamos indicadores de energía y acidez tisular general. El pH cardíaco es un indicador valioso, ya que el equilibrio ácido-base se interrumpe en las primeras etapas de enfermedades cardíacas y afecciones como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiencia cardíaca⁶.

La producción hiperpolarizada de [1-13 C]lactato y [13 C]bicarbonato a partir de piruvato hiperpolarizado [^1-13C]ayuda a determinar las tasas de producción de lactato deshidrogenasa (LDH) y piruvato deshidrogenasa (PDH). La mayoría de los estudios previos realizados utilizando sustratos hiperpolarizados en el corazón de roedor aislado utilizaron modelos cinéticos complejos para derivar la actividad enzimática de LDH y PDH, o informaron las relaciones de intensidad de señal del producto hiperpolarizado a un sustrato sin calcular las tasas reales de actividad enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10^{, 11,12,13,14}. Aquí, utilizamos el enfoque de saturación-excitaciones selectivas del producto 15, que permite el monitoreo de la actividad enzimática de manera libre de modelo^15,16. De esta manera, se determinaron las tasas enzimáticas absolutas (es decir, el número de moles de producto producido por unidad de tiempo). ³¹ La espectroscopia P se utilizó para observar las señales de fosfato inorgánico (Pi), fosfocreatina (PCr) y trifosfato de adenosina (ATP). Se utilizó un análisis multiparamétrico para caracterizar la distribución del pH del corazón, como lo demuestra el cambio químico heterogéneo en la señal Pi del tejido.

El corazón de ratón retrógrado perfundido (corazón de Langendorff)^17,18,19 es un modelo ex vivo para el corazón latente intacto. En este modelo, la viabilidad cardíaca y el pH se conservan durante al menos 80 min²⁰, y ha mostrado potencial de recuperación después de una lesión isquémica prolongada^21,22. Sin embargo, la variabilidad inadvertida durante la microcirugía puede conducir a la variabilidad en la viabilidad del tejido a través de los corazones. Estudios previos han reportado sobre el deterioro de este corazón a lo largo del tiempo¹⁹; Por ejemplo, se ha observado una reducción de la función contráctil del 5%-10% por hora¹⁸. La señal de trifosfato de adenosina (ATP) ha demostrado previamente que informa sobre el estado energético miocárdico y la viabilidad²³. Aquí, notamos que el corazón perfundido ocasionalmente puede mostrar una variabilidad involuntaria en los niveles de viabilidad, como lo demuestra el contenido de ATP, a pesar del hecho de que tuvimos un suministro ininterrumpido de perfusión y oxígeno. Demostramos aquí que normalizar las tasas de LDH y PDH al contenido de ATP del corazón reduce la variabilidad intercardíaca en estas tasas.

En el siguiente protocolo, describimos el procedimiento quirúrgico utilizado para la canulación cardíaca, el aislamiento y la consiguiente perfusión en el espectrómetro de RMN. Cabe destacar que otros enfoques quirúrgicos dirigidos a aislar y perfundir el corazón del ratón se han descrito antes de^24,25.

También se describen las metodologías utilizadas para adquirir datos relacionados con las tasas enzimáticas en el corazón latiendo (utilizando espectroscopia 13 C y piruvato hiperpolarizado [^1-13C]) y la viabilidad y acidez del corazón (utilizando espectroscopia de RMN ³¹P). Finalmente, se explican las metodologías analíticas para determinar las actividades enzimáticas metabólicas y la viabilidad y acidez de los tejidos.

Protocol

El comité conjunto de ética (IACUC) de la Universidad Hebrea y el Centro Médico Hadassah aprobaron el protocolo de estudio para el bienestar animal (MD-19-15827-1). 1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit Un día antes del experimento, prepare una versión modificada del tampón de Krebs-Henseleit (KHB)26. Inicialmente, disolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3 y 1,2 mM KH 2 PO<su…

Representative Results

Los espectros 31P registrados desde un corazón de ratón perfundido con KHB y solo desde el tampón se muestran en la Figura 1A. Las señales de α, β y γ-ATP, PCr y Pi se observaron en el corazón. La señal Pi estaba compuesta de dos componentes principales: en el campo más alto (lado izquierdo de la señal), la señal Pi se debía principalmente al KHB a un pH de 7,4; en el campo inferior (lado derecho de la señal), la señal Pi era más amplia y menos homogénea debido al…

Discussion

Demostramos una configuración experimental que está diseñada para investigar el metabolismo hiperpolarizado del piruvato [^1-13C], la energética de los tejidos y el pH en un modelo de corazón de ratón aislado.

Los pasos críticos dentro del protocolo son los siguientes: 1) asegurar que el pH del tampón sea 7.4; 2) garantizar que se incluyan todos los componentes del búfer; 3) evitar la coagulación de la sangre en los vasos cardíacos mediante inyecciones de heparina; 4) evit…

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments	52-ZNP91000	HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer	RS2D		NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump	Cole-Parmer	07554-95
Temperature probe	Osensa	FTX-100-LUX+	NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes	Cole-Parmer	HV-96119-16	L/S 16 I.D. 3.1 mm
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines	Upchurch Scientific		id. 0.040”
Intravenous catheter	BD Medical	381323	22 G
Silk suture	Ethicon	W577H	Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-8077-1
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074	CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	CAS: 50-99-77
Heparin sodium	Rotexmedica	HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37%	Sigma-Aldrich	258148	CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog)	Novo Nordisk
Isoflurane	Terrel
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	793612	CAS: 7487-88-9
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate	Gadot Group		CAS: 144-55-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	655104	CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S7907	CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate	Merck	6345	CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade)	Amresco	0826	CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063	GE Healthcare AS	NC100136	OX063
NMR standards
13C standard sample	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-72A	40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample	Made in house		105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016	Microsoft
MNova	Mestrelab Research