Um método para reativar células-tronco neurais quiescentes em explantas cerebrais de Drosophila cultivadas foi estabelecido. Usando este método, o papel dos sinais sistêmicos pode ser desacoplado a partir de sinais intrínsecos teciduais na regulação da quiescência de células-tronco neurais, entrada e saída.
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Artigo de método
Reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco neurais (NSCs) têm a capacidade de proliferar, diferenciar, sofrer apoptose, e até mesmo entrar e sair da quiescência. Muitos desses processos são controlados pela complexa interação entre programas genéticos intrínsecos do NSC com fatores extrínsecos do NSC, locais e sistêmicos. No organismo modelo genético, Drosophila melanogaster, NSCs, conhecidos como neuroblastos (NBs), mudam de quiescência para proliferação durante a transição embrionária para larval. Durante esse tempo, as larvas emergem de suas cascas de ovos e começam a engatinhar, buscando nutrientes dietéticos. Em resposta à alimentação animal, o corpo gordo, um órgão endócrino com capacidade de armazenamento lipídico, produz um sinal, que é liberado sistematicamente no hemoglifo circulante. Em resposta ao sinal derivado do corpo gordo (FBDS), peptídeos semelhantes à insulina drosophila (Dilps) são produzidos e liberados de neurônios neurosecretores cerebrais e glia, levando à ativação a jusante da sinalização de crescimento PI3-quinase em NBs e seu nicho glial e traqueial. Embora este seja o modelo atual de como os NBs mudam da quiescência para a proliferação, a natureza da sugestão extrínseca da FBDS permanece indescritível. Para entender melhor como as pistas sistêmicas extrínsecas da NB regulam a saída da quiescência, um método foi desenvolvido para cultivar cérebros larvais precoces in vitro antes da alimentação animal. Com este método, fatores exógenos podem ser fornecidos aos meios de comunicação cultural e à saída do NB da quiescência avaliada. Descobrimos que insulina exógena é suficiente para reativar NBs de quiescência em explantas cerebrais inteiras. Como este método é adequado para telas de grande escala, pretendemos identificar pistas extrínsecas adicionais que regulam as decisões de quiescência versus proliferação da NB. Como os genes e caminhos que regulam as decisões de proliferação do NSC são evolutivamente conservados, os resultados deste ensaio poderiam fornecer insights sobre a melhoria das terapias regenerativas na clínica.
Introdução
As células-tronco são de grande interesse devido ao seu potencial de uso na medicina regenerativa 1,2. Muitos animais, especialmente aqueles que são de longa duração, mantêm células-tronco dentro de seus tecidos adultos. Essas células-tronco residentes funcionam para manter a homeostase tecidual e são utilizadas para reparo após lesões físicas ou doença 3,4. A maioria das células-tronco em animais adultos são quiescentes, um estado relativamente adormecido caracterizado pela parada do ciclo celular e pela inativação da sinalização de crescimento
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Protocolo
1. Coleta de larvas de Drosophila
NOTA: Prepare a placa de levedura, a pasta de uva e o condomínio Fly antes de iniciar:
- Pasta de levedura: Em um recipiente pequeno, misture 5 g de levedura seca ativa com 10 mL de água para formar uma pasta que tenha a consistência de manteiga de amendoim. Cubra a pasta de levedura com plástico e use um elástico para fixá-lo firmemente ao recipiente.
NOTA: A pasta de levedura fresca se expandirá em seu recipiente e sairá da tampa, a menos que firmemente presa. A pasta de levedura durará vários dias em temperatura ambiente (RT). - Pratos de uva: Siga a receita p....
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Resultados
Cérebros selvagens recém-eclodidos do OregonR foram dissecados e cultivados por 24 h na mídia de Schneider (SSM) com insulina. Os tecidos foram fixados e manchados de acordo com o protocolo. Foram utilizados anticorpos primários gerados contra Deadpan (Dpn) para detectar NBs e Rabiscos para rotular membranas celulares. O analógico timmidina 5-Ethynyl-2′-desoxyuridina (Edu) foi adicionado para detectar a entrada da fase S e a reativação de NB. Encontramos NBs edu positivos de grande porte e DPN positivo após 24 horas em c.......
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Discussão
O método descrito aqui para cultivar explanações cerebrais pode ser realizado na maioria dos ambientes de laboratório. As ferramentas necessárias, bem como o procedimento e a coleta de dados, são simples e simples. Com este método, pode-se testar uma variedade de hipóteses, incluindo aquelas relacionadas às cascatas de sinalização celular e fatores extrínsecos que regulam a reativação e proliferação do RN. Aqui, usando animais oregonr de tipo selvagem, descobrimos que a insulina exógena era suficiente para reativar NBs d.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses concorrentes.
Agradecimentos
Reconhecemos o programa LSAMP Bridges to Doctorate para financiamento (CNK) e o NIH/NIGMS (R01-GM120421 e R35-GM141886). Somos gratos ao Dr. Conor Sipe pela Figura 1. Agradecemos também a todos os membros do laboratório Siegrist por seu apoio contínuo e mentoria. Agradecemos especialmente a Chhavi Sood e Gary Teeters por sua leitura cuidadosa do manuscrito e por fornecer comentários.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10 µ L Ponteiras de pipeta | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µ L Ponteiras de pipeta | Denville | Sci P2103-N | |
| 1000 µ L Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldeído (10 x 10 mL) | Ciências de Microscopia Eletrônica | 2912.60.0000 | Usado para Fixação de Cérebros Larvais |
| 20 µ Pipeta L | Gilson | P20 | |
| 200 µ L Pontas de pipeta | Denville Sci | 1158U56 | |
| Placas de cultura multipoços de 24 poços | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| Placas de Petri de 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | Placa de Uva Ingredientes |
| 4 ° C geladeira | Fisher Scientific | Fornece uma temperatura ideal para incubações de >24 h em solução de anticorpos | |
| 63x Objetivo | Lecia | ||
| Levedura seca ativa | A maioria dos supermercados | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Placa de uva Ingredientes |
| Click-iT EdU Kit de proliferação de células para imagem, Alexa Fluor 647 corante | Thermo Fisher Microscópio | C10340 | para Rotular Células |
| Proliferação | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , pacote de 10 de 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Duas Lamínulas são super coladas nas extremidades da lâmina do microscópio. Isso cria um espaço que permite que os cérebros flutuem em antifade enquanto são fotografados. |
| Lamínulas, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | A lamínula é colocada em duas lamínulas quadradas na lâmina do microscópio, garantindo que o cérebro no antifade não se mova durante a imagem. |
| Microscópio de dissecação | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Etanol 200 proof (100%), Decon Labs, garrafa de 1 galão | Fisher Scientific | 2701 | Usado para lavar as larvas antes da retenção de 24 horas em meio de cultura |
| Soro Fetal Bovino (10%) | Suplemento Sigma | F4135-100ML | para meios de cultura celular. |
| Pinça fina para dissecação | Ferramentas de Belas Ciências | 11295-20 | Forceptos usados em dissecações. Eles funcionam melhor quando afiados. |
| Garrafas de Mosca para Cruzamento | Genessee Scientific | 32-130 | Esta garrafa é usada como um recipiente que permite que as moscas ponham ovos no prato de uva. |
| Prato de Dissecção de Vidro (3 poços) | Estes não estão mais disponíveis | ||
| Glutationa | Sigma | G6013 | Fornece proteção oxidativa durante a cultura celular. |
| Soro de Cabra | Sigma | G9023- 10ML | Agente Bloqueador |
| Placas de Uva | Feito em casa | Feito em casa | Placas de suco de uva/agarose para coleta de ovos recém-nascidos |
| Imagem J | Imagej.net/fiji/downloads | Download Gratuito: https://fiji.sc | Plataforma de imagem que é usada para contar células e reativação Edu |
| Incubadora | Thermo Fisher Scientific | Garante que a temperatura, umidade e exposição à luz sejam exatamente as mesmas durante todo o experimento. | |
| Insulina | Sigma | I0516 | Variável independente do experimento |
| Capuz | Para alíquota de meios de cultura | ||
| L-Glutamina | Sigma | G7513 | Fornece suporte durante a cultura de células |
| Nunc 72-well Microwell Mini Bandejas | Fisher Scientific | 12-565-154 | As etapas de imunocoloração são realizadas nesta bandeja |
| Parafilme | Fisher Scientific | S37440 | Filme usado para selar placas a fim de evitar a evaporação |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiódicos usados para prevenir a contaminação bacteriana das células durante a cultura. |
| Tampão de Fosfato, pH7.4 | Feito em casa | Feito em casa | Solvente usado para lavar o cérebro após as etapas de fixação e coloração |
| Escolha | Ferramentas de Ciência Fina | 10140-01 | Usado para pegar larvas do prato de uva |
| Ácido propiônico | Fisher Scientific | A-258 | Ingredientes do Prato de Uva |
| Coelho 405 | Abcam | ab175653 | Anticorpos usados para imunocoloração |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Anticorpos usados para imunocoloração |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Anticorpos usados para imunocoloração | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Anticorpos usados para imunocoloração |
| Schneiders Culture Medium | Life | Tech 21720024 | Contém nutrientes que ajudam as células a crescer e proliferar |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagente que fornece proteção contra fluoróforos desbotados |
| Autoclave de Água Estéril | Água Milli-Q feita em casa | Necessário para Soluções | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Placa de Uva Ingredientes Lâminas |
| Microscópio Superfrost | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Supercola | A maioria dos supermercados | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Ingredientes do Prato de Uva |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% suco de uva | A maioria dos supermercados | Ingredientes do Prato de Uva |
Referências
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Plur....
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Reimpressões e permissões
