Высокопроизводительная конфокальная визуализация квантовых точек-конъюгированных пиковых тримеров SARS-CoV-2 для отслеживания связывания и эндоцитоза в клетках HEK293T
Summary
В этом протоколе квантовые точки, конъюгированные с рекомбинантным всплеском SARS-CoV-2, позволяют клеточным анализам контролировать связывание шипов с hACE2 на плазматической мембране и последующий эндоцитоз связанных белков в цитоплазму.
Abstract
Разработка новых технологий клеточной флуоресцентной микроскопии облегчила высокопроизводительные методы скрининга для открытия лекарств. Квантовые точки представляют собой флуоресцентные наночастицы с отличными фотофизическими свойствами, проникнутыми яркой и стабильной фотолюминесценцией, а также узкими эмиссионными полосами. Квантовые точки имеют сферическую форму и при правильной модификации химического состава поверхности могут использоваться для сопряжения биомолекул для клеточных применений. Эти оптические свойства в сочетании со способностью функционализировать их с биомолекулами делают их отличным инструментом для исследования рецептор-лигандных взаимодействий и клеточного трафика. Здесь мы представляем метод, который использует квантовые точки для отслеживания связывания и эндоцитоза спайкового белка SARS-CoV-2. Этот протокол может быть использован в качестве руководства для экспериментаторов, желающих использовать квантовые точки для изучения белково-белковых взаимодействий и торговли в контексте клеточной физиологии.
Introduction
Флуоресцентная микроскопия позволяет исследователям заглянуть во внутреннюю работу клетки, используя специализированные красители1, генетически закодированные флуоресцентные белки2 и флуоресцентные наночастицы в виде квантовых точек (QD)3. Для глобальной пандемии коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2019 года (SARS-CoV-2) исследователи использовали флуоресцентную микроскопию, чтобы понять, как вирус взаимодействует с клеткой как на плазматической мембране, так и в цитоплазме. Например, исследователи смогли получить представление о связывании белка SARS-CoV-2 Spike на поверхности вириона с человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) на поверхности клеток человека, последующей интернализацией через слияние на плазматической мембране и эндоцитозом белкового комплекса Spike: hACE24,5. Также было получено большое понимание выхода SARS-CoV-2 из клеток через лизосому с использованием клеточной флуоресцентной визуализации, уникальной особенности коронавирусов, которые, как ранее считалось, происходят через традиционное пузырьковое почкование из Гольджи, как и со многими другими вирусами6. Являясь основой почти всех аспектов биологических исследований, метод клеточной флуоресцентной микроскопии обязательно продвинулся в своей широте и области применения от визуализации со сверхвысоким разрешением целых животных до автоматизированной многопараметрической визуализации с высоким содержанием для скрининга лекарств. Здесь автоматизированная конфокальная микроскопия с высоким содержанием применяется для исследования проникновения в клетки SARS-CoV-2 с использованием флуоресцентных QD, конъюгированных с вирусным спайковым белком.
Анализ изображений с высоким содержанием, генерируемых платформами биологической визуализации, позволяет получить большую ценную биологическую информацию, чем отдельные параметры, такие как интенсивность всей скважины, которые можно было бы получить с помощью мультимодального считывателя пластин7. Разделяя объекты в поле зрения с помощью автоматизированных алгоритмов сегментации, каждый объект или совокупность объектов могут быть проанализированы по таким параметрам, как интенсивность, площадь и текстура в каждом доступном флуоресцентном канале8. Объединение многих измерений в многомерные наборы данных является полезным подходом для фенотипического профилирования. Когда желаемый фенотип известен, например, интернализация QD в форме пункты, можно использовать измерения, связанные с пунктой, такие как размер, количество и интенсивность, для оценки эффективности лечения.
Облачное программное обеспечение для анализа изображений с высоким содержанием может вместить большое разнообразие выходных данных приборов, включая платформу обработки изображений с высоким содержанием. Используя облачный сервер для хранения изображений и онлайн-анализа, пользователь может загружать свои данные либо с инструмента обработки изображений, либо с сетевого диска, на котором хранятся данные. Аналитическая часть протокола проводится в облачной программной среде, и данные могут быть экспортированы в различные форматы файлов для последующей визуализации данных.
Вирус SARS-CoV-2 состоит из неструктурных и структурных белков, которые помогают в его сборке и репликации. Спайк SARS-CoV-2 имеет два домена, называемых S1 и S2, причем S1 содержит рецептор-связывающий домен, ответственный за взаимодействия hACE2 в плазматической мембране9. Также было обнаружено, что Спайк взаимодействует с другими молекулами плазматической мембраны, которые могут действовать как корецепторы в дополнение к hACE210,11. По всей последовательности спайкового белка и особенно на границе раздела S1/S2 существуют участки расщепления протеазы, которые позволяют сращиваться на мембране после трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2)12. Различные рекомбинантные белки SARS-CoV-2 Spike были получены из отдельных рецепторсвязывающих доменов до S1, S2, S1 с S2 и целых тримеров шипов от нескольких коммерческих поставщиков для использования в исследовательской деятельности13.
В этой работе поверхность QD была функционализирована рекомбинантными шиповыми тримерами, которые содержат гистидиновую метку (QD-Spike). QD, производимые Отделом оптических наноматериалов Военно-морской исследовательской лаборатории, содержат ядро селенида кадмия и оболочку сульфида цинка14,15. Цинк на поверхности QD координирует остатки гистидина в рекомбинантном белке, образуя функционализированный QD, который по форме и функции напоминает вирусную частицу SARS-CoV-2. Генерация наночастиц и конъюгация белка были ранее описаны с использованием QD-конъюгированного рецепторсвязывающего домена15. Этот метод описывает препараты клеточной культуры, лечение QD, сбор изображений и протокол анализа данных, которые могут направлять исследователя в изучении активности SARS-CoV-2 Spike в физиологическом контексте клетки человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный в этой статье, обеспечивает необходимые шаги для визуализации функционализированных QD в клетках человека с использованием высокопроизводительной конфокальной микроскопии. Этот метод лучше всего подходит для клеток, где эндоцитоз является основным путем проникновен…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований Национального центра продвижения трансляционных наук, NIH. Военно-морская исследовательская лаборатория предоставила финансирование через свой внутренний Институт нанонауки. Препарат реагентов поддерживался через базовый фонд NRL COVID-19.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
Referências
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
