HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징
Summary
이 프로토콜에서, 재조합 SARS-CoV-2 스파이크에 접합된 양자점은 세포-기반 분석을 가능하게 하여 원형질막에서 hACE2에 대한 스파이크 결합 및 세포질 내로의 결합된 단백질의 후속 엔도사이토시스를 모니터링한다.
Abstract
세포 형광 현미경 검사를위한 새로운 기술의 개발은 약물 발견을위한 고처리량 스크리닝 방법을 촉진했습니다. 양자점은 밝고 안정적인 광발광뿐만 아니라 좁은 발광 대역으로 스며든 우수한 광물리학적 특성을 가진 형광 나노입자입니다. 양자점은 구형이며, 표면 화학의 적절한 변형과 함께, 세포 응용을 위해 생체분자를 접합하는데 사용될 수 있다. 이러한 광학 특성은 생체 분자로 기능화 할 수있는 능력과 결합하여 수용체 – 리간드 상호 작용 및 세포 밀매를 조사하기위한 훌륭한 도구입니다. 여기에서는 양자점을 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합 및 엔도사이토시스를 추적하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 양자점을 활용하여 세포 생리학의 맥락에서 단백질-단백질 상호작용 및 인신매매를 연구하고자 하는 실험가들을 위한 가이드로 사용될 수 있다.
Introduction
형광 현미경을 통해 연구원은 특수 염료1, 유전적으로 인코딩된 형광 단백질2 및 양자점(QD) 형태의 형광 나노입자를 사용하여 세포의 내부 작용을 조사할 수 있습니다3. 2019 년 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2) 세계적인 유행병의 경우, 연구자들은 바이러스가 원형질막과 세포질에서 세포와 어떻게 상호 작용하는지 이해하기 위해 형광 현미경을 사용했습니다. 예를 들어, 연구자들은 비리온 표면의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 인간 세포 표면의 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (hACE2)의 결합, 원형질막에서의 융합을 통한 후속 내재화 및 스파이크 : hACE2 단백질 복합체의 내시세포증4,5에 대한 통찰력을 얻을 수있었습니다. 또한 세포 형광 이미징을 사용하여 리소좀을 통해 세포로부터 SARS-CoV-2 유출 에 대한 훌륭한 통찰력을 얻었는데, 이는 이전에 골지에서 싹트는 전통적인 소포를 통해 발생하는 것으로 생각되었던 코로나 바이러스의 독특한 특징입니다6 다른 많은 바이러스와 마찬가지로. 생물학적 연구의 거의 모든 측면의 주류 인 세포 형광 현미경 검사 기술은 전체 동물의 초해상도 이미징에서 약물 스크리닝을위한 자동화 된 고함량 다중 파라 메트릭 이미징에 이르기까지 광범위한 응용 분야에서 필연적으로 발전해 왔습니다. 여기서, 자동화된 고함량 공초점 현미경은 바이러스 스파이크 단백질에 접합된 형광 QDs를 사용하는 SARS-CoV-2 세포 진입의 연구에 적용된다.
생물학적 이미징 플랫폼에 의해 생성된 이미지의 고함량 분석은 다중 모드 플레이트 리더를 사용하여 얻을 수 있는 전체 웰 강도와 같은 단일 파라미터보다 귀중한 생물학적 통찰력을 더 크게 추출할 수 있게 해줍니다7. 자동화된 세분화 알고리즘을 사용하여 시야에서 객체를 분리함으로써, 각각의 오브젝트 또는 오브젝트 집단은 각각의 이용가능한 형광 채널8에서 강도, 면적 및 텍스처와 같은 파라미터에 대해 분석될 수 있다. 많은 측정값을 다변량 데이터 세트에 결합하는 것은 표현형 프로파일링에 유용한 접근 방식입니다. 원하는 표현형, 예를 들어 누점 형태의 QD 내재화가 알려져 있는 경우, 치료의 효능을 평가하기 위해 크기, 수 및 강도와 같은 누자와 관련된 측정을 사용할 수 있다.
클라우드 기반 고콘텐츠 이미징 분석 소프트웨어는 고콘텐츠 이미징 플랫폼을 포함한 다양한 계측기 데이터 출력을 수용할 수 있습니다. 이미지 저장 및 온라인 분석을 위해 클라우드 기반 서버를 사용함으로써 사용자는 이미징 장비 또는 데이터가 저장된 네트워크 드라이브에서 데이터를 업로드 할 수 있습니다. 프로토콜의 분석 부분은 클라우드 소프트웨어 환경 내에서 수행되며 다운스트림 데이터 시각화를 위해 다양한 파일 형식으로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
SARS-CoV-2 바이러스는 조립 및 복제를 돕는 비구조 및 구조 단백질로 구성됩니다. SARS-CoV-2 스파이크는 S1과 S2라는 두 개의 도메인을 가지고 있으며, S1은 원형질막에서 hACE2 상호 작용을 담당하는 수용체 결합 도메인을 포함합니다9. 스파이크는 또한 hACE210,11 이외에 공동-수용체로서 작용할 수 있는 원형질막에서 다른 분자들과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 스파이크 단백질 서열 전체에서, 특히 S1/S2 계면에서, 막횡단 세린 프로테아제 2 (TMPRSS2)12 이후 막에서 융합을 가능하게 하는 프로테아제 절단 부위가 존재한다. 다양한 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 개별 수용체 결합 도메인으로부터 S1, S2, S1 및 S2를 갖는 S2 및 전체 스파이크 트리머로부터 연구 활동에 사용하기 위해 여러 상업 벤더로부터 생산되었다13.
이 작업에서, QDs의 표면은 히스티딘 태그 (QD-Spike)를 포함하는 재조합 스파이크 트리머로 기능화되었다. 해군 연구소 광학 나노 물질 섹션에서 생산 한 QD에는 카드뮴 셀레나이드 코어와 황화아연 쉘14,15가 포함되어 있습니다. QD 표면 상의 아연은 재조합 단백질 내의 히스티딘 잔기를 좌표화하여 형태와 기능면에서 SARS-CoV-2 바이러스 입자와 유사한 기능화된 QD를 형성한다. 나노입자의 생성과 컨쥬게이션된 단백질은 QD 컨쥬게이션된 수용체 결합 도메인15를 사용하여 이전에 기술되었다. 이 방법은 인간 세포의 생리적 맥락에서 SARS-CoV-2 스파이크 활성을 연구하는 연구자를 안내 할 수있는 세포 배양 준비, QD 치료, 이미지 수집 및 데이터 분석 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에 설명 된 방법은 고처리량 공초점 현미경을 사용하여 인간 세포에서 기능화 된 QD를 이미징하는 데 필요한 단계를 제공합니다. 이 방법은 SARS-CoV-2 스파이크 및 hACE2 엔도사이토시스에 대한 연구를 가능하게 하기 때문에 TMPRSS2 및 막 융합의 활성보다는 엔도사이토시스가 바이러스 진입의 주요 경로인 세포에 가장 적합합니다. QD 모델 및 상업적으로 입수가능한 스파이크 삼량체 상의 C-말단…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 국립 번역 과학 발전 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 해군 연구소는 내부 나노 과학 연구소를 통해 자금을 제공했습니다. 시약 준비는 NRL COVID-19 기본 기금을 통해 지원되었습니다.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
Referências
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
