JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioquímica

In vitro Karakterisering af histon chaperoner ved hjælp af analytiske, pull-down og chaperoning assays

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63218
, , , , , , , , ,
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology,KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry,Yale University, 5Department of Pharmacology,University of Vermont College of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver et batteri af metoder, der inkluderer analytisk størrelsesekskluderingskromatografi til at studere histon chaperone oligomerisering og stabilitet, pull-down assay for at opklare histon chaperon-histon-interaktioner, AUC til at analysere støkiometrien af proteinkomplekserne og histon chaperoning assay for funktionelt at karakterisere en formodet histon chaperone in vitro.

Abstract

Histonproteiner associeres med DNA for at danne det eukaryote kromatin. Den grundlæggende enhed af kromatin er et nukleosom, der består af en histonoktamer bestående af to kopier af kernehistonerne H2A, H2B, H3 og H4, viklet rundt af DNA’et. Octamere består af to kopier af en H2A/H2B dimer og en enkelt kopi af en H3/H4 tetramer. De højt ladede kernehistoner er tilbøjelige til ikke-specifikke interaktioner med flere proteiner i den cellulære cytoplasma og kernen. Histone chaperoner danner en forskelligartet klasse af proteiner, der transporterer histoner fra cytoplasmaet ind i kernen og hjælper deres aflejring på DNA’et og dermed hjælper nukleosomsamlingsprocessen. Nogle histon chaperoner er specifikke for enten H2A / H2B eller H3 / H4, og nogle fungerer som chaperoner for begge. Denne protokol beskriver, hvordan in vitro-laboratorieteknikker såsom pull-down-assays, analytisk størrelsesekskluderingskromatografi, analytisk ultracentrifugering og histon chaperoning-assay kan bruges sammen for at bekræfte, om et givet protein er funktionelt som en histon chaperon.

Introduction

Nukleosomer sammensat af DNA- og histonproteiner danner den strukturelle enhed af kromatin og regulerer flere kritiske cellulære hændelser. Nukleosomer omplaceres dynamisk og ombygges for at gøre DNA tilgængeligt for forskellige processer såsom replikation, transkription og oversættelse 1,2. Histoner, der er meget basiske, har enten tendens til at interagere med sure proteiner i det cellulære miljø eller gennemgå aggregering, hvilket fører til forskellige cellulære defekter 3,4,5. En gruppe dedikerede proteiner kaldet histon chaperoner hjælper transporten af histoner fra cytoplasmaet til kernen og forhindrer afvigende histon-DNA-aggregeringshændelser 6,7. Grundlæggende opbevarer og overfører de fleste histonkaperoner histoner til DNA ved fysiologisk ionstyrke og derved hjælper dannelsen af nukleosomer 8,9. Nogle histon chaperoner har en klar præference for histon oligomerer H2A / H2B eller H3 / H410.

Histone chaperoner er karakteriseret baseret på deres evne til at samle nukleosomer afhængige eller uafhængige af DNA-syntese11. For eksempel er kromatinsamlingsfaktor-1 (CAF-1) afhængig, mens histonregulator A (HIRA) er uafhængig af DNA-syntese12,13. Tilsvarende er nukleoplasminfamilien af histon chaperoner involveret i sædkromatindekondensation og nukleosomsamling14. Nukleosomsamlingsproteinet (NAP) familiemedlemmer letter dannelsen af nukleosomlignende strukturer in vitro og er involveret i shuttling af histoner mellem cytoplasma og kerne15. Nukleoplasminer og NAP-familieproteiner er begge funktionelle histonchaperoner, men deler ingen strukturelle træk. I det væsentlige tillader ingen enkelt strukturel funktion klassificering af et protein som en histon chaperone16. Brugen af funktionelle og biofysiske assays sammen med strukturelle undersøgelser fungerer bedst til at karakterisere histon chaperoner.

Dette arbejde beskriver biokemiske og biofysiske metoder til at karakterisere et protein som en histon chaperon, der hjælper nukleosom samling. For det første blev analytisk størrelsesekskluderingskromatografi udført for at analysere den oligomere status og stabilitet af histonchaperoner. Dernæst blev der udført et pull-down-assay for at bestemme drivkræfterne og den konkurrencemæssige karakter af histon chaperone-histon-interaktioner. Imidlertid kunne de hydrodynamiske parametre for disse interaktioner ikke beregnes nøjagtigt ved hjælp af analytisk størrelsesekskluderingskromatografi på grund af proteinets form og dets komplekser, der påvirker deres migration gennem søjlen. Derfor blev analytisk ultracentrifugering anvendt, hvilket giver makromolekylære egenskaber i opløsning, der inkluderer nøjagtig molekylvægt, interaktionens støkiometri og formen af de biologiske molekyler. Tidligere undersøgelser har i vid udstrækning brugt in vitro histon chaperoning assay til funktionelt at karakterisere histon chaperoner såsom yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Histone chaperoning assay blev også brugt til funktionelt at karakterisere proteinerne som histon chaperoner.

Protocol

1. Analytisk størrelsesekskluderingskromatografi til belysning af histonchaperoners oligomere status og stabilitet Analyse af histon chaperoners oligomere statusÆkvivalent mellem en 24 ml analytisk størrelsesekskluderende kromatografi (SEC) kolonne med 1,2 kolonnevolumen (CV), dvs. 28,8 ml afgasset SEC-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl og 1 mM β-mercaptoethanol (β-ME)] ved 4 °C (se materialetabel).BEMÆRK: Kolonnetype, buffersammensætning og buffer…

Representative Results

Det rekombinante N-terminale nukleoplasmindomæne af proteinet FKBP53 fra Arabidopsis thaliana blev udsat for analytisk SEC. Elutionstopvolumenet blev plottet mod standardkurven for at identificere dets oligomere tilstand. De analytiske SEC-resultater afslørede, at domænet eksisterer som en pentamer i opløsning med en omtrentlig molekylmasse på 58 kDa (figur 1A, B). Endvidere blev nukleoplasmindomænet analyseret for termisk og kemisk stabilitet i forbindelse me…

Discussion

Dette arbejde demonstrerer og validerer et omfattende sæt protokoller til biokemisk og biofysisk karakterisering af en formodet histon chaperone. Heri blev rekombinant udtrykte og oprensede NAP-familieproteiner, AtNRP1 og AtNRP2, og det N-terminale nukleoplasmindomæne af AtFKBP53 brugt til at demonstrere protokollerne. Det samme sæt eksperimenter kunne meget vel bruges til at afgrænse de funktionelle egenskaber ved tidligere ukarakteriserede histonchaperoner fra enhver organisme.

Den førs…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De ekstramurale tilskud til Dileep Vasudevan fra Science and Engineering Research Board, Indiens regering [CRG/2018/000695/PS] og Institut for Bioteknologi, Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Indiens regering [BT/INF/22/SP33046/2019] samt den intramurale støtte fra Institute of Life Sciences, Bhubaneswar anerkendes i høj grad. Vi takker fru Sudeshna Sen og fru Annapurna Sahoo for deres hjælp med histonpræparation. Diskussionerne med vores kolleger Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev og Dr. Shaikh Nausad Hossain anerkendes også.

Materials

Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Tags

Keywords: Histone ChaperonesPull-down AssaysAnalytical Size Exclusion ChromatographyAnalytical Ultra-centrifugationHistone Chaperoning AssayChromatin ResearchH2A/H2B DimerH3/H4 TetramerSDS-PAGECoomassie Brilliant Blue R250Dialysis BufferAnalytical Ultra Centrifuge
check_url/pt/63218?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image