عزل خلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية للدراسات الكهروفسيولوجية
Summary
يصف هذا البروتوكول العزلة الحادة لخلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية القابلة للحياة من أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية (Danio rerio) ، وهي مناسبة للدراسات الكهربية.
Abstract
منذ فترة طويلة تستخدم أسماك الزرد ككائن فقاري نموذجي في أبحاث القلب والأوعية الدموية. كانت الصعوبات التقنية لعزل الخلايا الفردية عن أنسجة القلب والأوعية الدموية لأسماك الزرد محدودة في دراسة خصائصها الكهروفسيولوجية. تم وصف الطرق السابقة لتشريح قلوب أسماك الزرد وعزل الخلايا العضلية القلبية البطينية. ومع ذلك ، لم يتم تفصيل عزل الخلايا العضلية الأذينية والوعائية لأسماك الزرد للتوصيف الكهروفسيولوجي. يصف هذا العمل البروتوكولات الأنزيمية الجديدة والمعدلة التي توفر بشكل روتيني خلايا عضلية بطينية وأذينية معزولة من أسماك الزرد الصغرى والبالغة ، بالإضافة إلى خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSM) من الشرايين المنتفخة ، وهي مناسبة لتجارب المشبك الرقعة. لم يكن هناك أي دليل أدبي على الدراسات الكهروفسيولوجية على أنسجة القلب والأوعية الدموية لأسماك الزرد المعزولة في مراحل التطور الجنينية واليرقات. يتم عرض تقنيات التفكك الجزئي التي تسمح بتجارب المشبك التصحيحي على الخلايا الفردية من اليرقات والقلوب الجنينية.
Introduction
الزرد هي أسماك تيليوست صغيرة تستخدم منذ فترة طويلة ككائن فقاري نموذجي1 وبرزت مؤخرا كنظام فقاري قابل للحياة لفحص الجينات والأدوية عالية الإنتاجية 2,3. ومع ذلك ، فإن التحليل الفسيولوجي لأنسجة الزرد ليس متطورا بشكل جيد. في نظام القلب والأوعية الدموية ، تم وصف طرق لتشريح قلوب الزرد4 وعزل الخلايا العضلية القلبية البطينية5،6،7. هناك عدد قليل من الأوصاف التفصيلية للعزل الفعال للخلايا العضلية الأذينية ولا توجد تقارير عن استعدادات العضلات الملساء الوعائية (VSM) لدراسات المشبك الرقعي.
يصف العمل الحالي منهجية عزل الخلايا العضلية القلبية والوعائية لأسماك الزرد ، وهي قابلة للتطبيق للدراسات الكهروفسيولوجية والوظيفية. يتضمن هذا النهج تعديلات على البروتوكولات المبلغ عنها سابقا لعزل الخلايا العضلية البطينية لأسماك الزرد 5,6 ويكيف الطرق من عزل خلايا VSM للثدييات8 ، مما يسمح بعزل خلايا العضلات الملساء الوعائية لأسماك الزرد عن الشرايين المنتفخة (BA). تؤدي البروتوكولات إلى غلة فعالة للخلايا الأذينية والبطينية و VSM المعزولة من أسماك الزرد التي يمكن استخدامها بشكل موثوق في دراسات المشبك التصحيحي لمدة تصل إلى 8 ساعاتو 9.
على الرغم من يرقاتها الشفافة تقريبا التي تتطور بالكامل خارج الكائن الحي الأبوي ، إلا أن استكشاف إمكاناتها الجينية الموعودة في دراسة تطور القلب والأوعية الدموية كان محدودا بسبب التحديات في استخراج الأنسجة وتحليلها في سن مبكرة. تتناول المقالة الحالية هذا القيد من خلال إظهار تجارب المشبك التصحيحي على قلوب الزرد المعزولة في وقت مبكر من 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، باستخدام طريقة استخراج منشورة ومكيفة10.
Protocol
Representative Results
Discussion
كانت الطرق السابقة لعزل الخلايا العضلية البطينية لأسماك الزرد 5,6 ، التي تهدف إلى توليد الخلايا العضلية للزراعة أو الدراسات الكهروفسيولوجية ، توفر خلايا ذات عائد أقل وتنطوي على خطوات طويلة من أجهزة الطرد المركزي المتعددة التي تؤثر سلبا على جودة الخلية وقاب…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL140024 إلى CGN و HL150277 إلى CMC. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 مع BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
Referências
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
