Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies
Summary
Het huidige protocol beschrijft de acute isolatie van levensvatbare cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen (Danio rerio), geschikt voor elektrofysiologische studies.
Abstract
Zebravissen worden al lang gebruikt als een model gewerveld organisme in cardiovasculair onderzoek. De technische problemen bij het isoleren van individuele cellen uit de cardiovasculaire weefsels van zebravissen zijn beperkend geweest bij het bestuderen van hun elektrofysiologische eigenschappen. Eerdere methoden zijn beschreven voor dissectie van zebravisharten en isolatie van ventriculaire cardiale myocyten. De isolatie van zebravis atriale en vasculaire myocyten voor elektrofysiologische karakterisering was echter niet gedetailleerd. Dit werk beschrijft nieuwe en gemodificeerde enzymatische protocollen die routinematig geïsoleerde juveniele en volwassen zebravisventrikel- en atriale cardiomyocyten bieden, evenals vasculaire gladde spiercellen (VSM) van de bolvormige arteriosus, geschikt voor patch-clamp experimenten. Er is geen literair bewijs van elektrofysiologische studies op cardiovasculaire weefsels van zebravissen geïsoleerd in embryonale en larvale ontwikkelingsstadia. Gedeeltelijke dissociatietechnieken die patch-clamp experimenten op individuele cellen van larvale en embryonale harten mogelijk maken, worden gedemonstreerd.
Introduction
Zebravissen zijn kleine teleostvissen die al lang worden gebruikt als een model gewerveld organisme1 en onlangs op de voorgrond zijn gekomen als een levensvatbaar gewerveld systeem voor high throughput screening van genen en geneesmiddelen 2,3. Fysiologische analyse van zebravisweefsels is echter niet goed ontwikkeld. In het cardiovasculaire systeem zijn methoden beschreven voor dissectie van zebravisharten4 en isolatie van ventriculaire cardiale myocyten 5,6,7. Er zijn weinig gedetailleerde beschrijvingen van de effectieve isolatie van atriale myocyten en geen meldingen van vasculaire gladde spieren (VSM) preparaten voor patch-clamp studies.
Het huidige werk beschrijft de methodologie voor de isolatie van zebravis cardiale en vasculaire myocyten, levensvatbaar voor elektrofysiologische en functionele studies. Deze aanpak omvat wijzigingen van eerder gerapporteerde protocollen voor zebravisventrikelmyocytenisolatie 5,6 en past methoden aan van VSM-celisolaties van zoogdieren8, waardoor de isolatie van zebravis vasculaire gladde spiercellen uit de bolvormige arteriosus (BA) mogelijk wordt. De protocollen resulteren in efficiënte opbrengsten van geïsoleerde atriale, ventriculaire en VSM-cellen van zebravissen die betrouwbaar kunnen worden gebruikt in patchklemstudies tot 8 uur9.
Ondanks hun bijna transparante larven die zich volledig buiten het ouderlijk organisme ontwikkelen, is het verkennen van hun beloofde ontogenetische potentieel bij het bestuderen van cardiovasculaire ontwikkeling beperkt door uitdagingen bij het extraheren en analyseren van weefsels op jonge leeftijd. Het huidige artikel behandelt deze beperking door patch-clamp experimenten te demonstreren op zebravisharten die al 3 dagen na de bevruchting (dpf) zijn geïsoleerd, met behulp van een aangepaste, gepubliceerde extractiemethode10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere methoden voor het isoleren van zebravisventrikelmyocyten 5,6, gericht op het genereren van myocyten voor kweek- of elektrofysiologische studies, leverden cellen met een lagere opbrengst en omvatten lange stappen van meerdere centrifugaties die de celkwaliteit en levensvatbaarheid nadelig beïnvloedden. De hier beschreven protocollen zijn betrouwbaar, bestrijken elk van de belangrijke cardiovasculaire weefsels (ventrikel, boezems en VSM) en zijn belangrijk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies HL140024 aan CGN en HL150277 aan CMC. Figuur 1 en figuur 2 zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
Referências
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
