Isolering av hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksen, juvenil, larve og embryonal sebrafisk for elektrofysiologiske studier
Summary
Denne protokollen beskriver akutt isolering av levedyktige hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksen, juvenil, larve og embryonal sebrafisk (Danio rerio), egnet for elektrofysiologiske studier.
Abstract
Sebrafisk har lenge vært brukt som en modell vertebrate organisme i kardiovaskulær forskning. De tekniske vanskelighetene med å isolere individuelle celler fra sebrafiskens kardiovaskulære vev har vært begrensende for å studere deres elektrofysiologiske egenskaper. Tidligere metoder er beskrevet for disseksjon av sebrafiskhjerter og isolering av ventrikulære hjertemyocytter. Isoleringen av sebrafiskatrielle og vaskulære myocytter for elektrofysiologisk karakterisering var imidlertid ikke detaljert. Dette arbeidet beskriver nye og modifiserte enzymatiske protokoller som rutinemessig gir isolerte juvenile og voksne sebrafisk ventrikulære og atrielle kardiomyocytter, samt vaskulær glatt muskulatur (VSM) celler fra bulbous arteriosus, egnet for patch-clamp eksperimenter. Det har ikke vært noe litterært bevis på elektrofysiologiske studier på sebrafisk kardiovaskulært vev isolert ved embryonale og larvestadier av utvikling. Delvis dissosiasjonsteknikker som tillater patch-clamp eksperimenter på individuelle celler fra larve og embryonale hjerter er demonstrert.
Introduction
Sebrafisk er små teleostfisk som lenge har vært brukt som modellvirveldyrorganisme 1 og har nylig blitt fremtredende som et levedyktig virveldyrsystem for høy gjennomstrømningsscreening av gener og legemidler 2,3. Imidlertid er fysiologisk analyse av sebrafiskvev ikke godt utviklet. I hjerte- og karsystemet er det beskrevet metoder for disseksjon av sebrafiskhjerter4 og isolering av ventrikulære hjertemyocytter 5,6,7. Det er få detaljerte beskrivelser av effektiv isolering av atriemyocytter og ingen rapporter om vaskulære glatte muskelpreparater (VSM) for patch-clamp-studier.
Det nåværende arbeidet beskriver metodikk for isolering av sebrafisk hjerte- og vaskulære myocytter, levedyktig for elektrofysiologiske og funksjonelle studier. Denne tilnærmingen inkluderer modifikasjoner av tidligere rapporterte protokoller for sebrafisk ventrikulær myocyttisolasjon5,6 og tilpasser metoder fra pattedyrs VSM-celleisolasjoner8, noe som muliggjør isolering av sebrafisk vaskulære glatte muskelceller fra bulbous arteriosus (BA). Protokollene resulterer i effektive utbytter av isolerte atrielle, ventrikulære og VSM-celler fra sebrafisk som pålitelig kan brukes i patch-clamp-studier i opptil 8 timer9.
Til tross for deres nesten gjennomsiktige larver som utvikler seg helt utenfor foreldrenes organisme, har det å utforske deres lovede ontogenetiske potensial ved å studere kardiovaskulær utvikling vært begrenset av utfordringer med å trekke ut og analysere vev i ung alder. Den nåværende artikkelen adresserer denne begrensningen ved å demonstrere patch-clamp-eksperimenter på sebrafiskhjerter isolert så tidlig som 3 dager etter befruktning (dpf), ved hjelp av en tilpasset, publisert ekstraksjonsmetode10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere metoder for å isolere sebrafisk ventrikulære myocytter5,6, med sikte på å generere myocytter for kultur eller elektrofysiologiske studier, ga celler med lavere utbytte og involverte lange trinn med flere sentrifugeringer som påvirket cellekvaliteten og levedyktigheten negativt. Protokollene beskrevet her er pålitelige, dekker hvert av de signifikante kardiovaskulære vevene (ventrikel, atria og VSM), og viktigere er ganske praktiske for akutt isol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd HL140024 til CGN og HL150277 til CMC. Figur 1 og figur 2 ble opprettet med BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
Referências
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
