הפרוטוקול הנוכחי מספק מידע הדרכה לשימוש בתולעת טבק מנדוקה סקסטה במחקר קנבינואידים. השיטה המתוארת כאן כוללת את כל האספקה והפרוטוקולים הדרושים לניטור שינויים פיזיולוגיים והתנהגותיים של מודל החרקים בתגובה לטיפול בקנבידיול (CBD).
עם תשומת לב מוגברת על קנבינואידים ברפואה, מספר אורגניזמים מודל יונקים שימשו כדי להבהיר את תפקודי התרופות הלא ידועים שלהם. עם זאת, קשיים רבים נותרו במחקר היונקים, המחייב פיתוח של אורגניזמים מודל שאינם יונקים למחקר קנבינואידים. המחברים מציעים את תולעת הטבק מנדוקה סקסטה כמערכת מודל חרקים חדשנית. פרוטוקול זה מספק מידע על הכנת הדיאטה המלאכותית עם כמויות משתנות של קנבידיול (CBD), הקמת סביבת גידול, וניטור השינויים הפיזיולוגיים וההתנהגותיים שלהם בתגובה לטיפול CBD. בקצרה, עם קבלת ביצי תולעי קרן, הביצים הורשו 1-3 ימים ב 25 °C (65 °F) על מחזור 12:12 כהה בהיר לבקוע לפני שהופץ באופן אקראי לשליטה (תזונה מלאכותית המבוססת על נבט חיטה; AD), רכב (AD + 0.1% שמן טריגליצרידים בשרשרת בינונית; שמן MCT) וקבוצות טיפול (AD + 0.1% MCT + 1 מ”מM או 2 מ”מ של CBD). ברגע שהתקשורת הוכנה, זחלי הכוכב הראשון הונחו בנפרד במבחנה של 50 מ”ל עם מקל שיפוד מעץ, ואז המבחנה כוסתה במטלית גבינה. המדידות נלקחו במרווחי זמן של יומיים לתגובות פיזיולוגיות והתנהגותיות לממשל CBD. הליך טיפוח פשוט זה מאפשר לחוקרים לבחון דגימות גדולות בניסוי נתון. בנוסף, מחזורי החיים הקצרים יחסית מאפשרים לחוקרים לחקור את ההשפעה של טיפולי קנבינואידים על פני דורות רבים של אוכלוסייה הומוגנית, ומאפשרים לנתונים לתמוך בעיצוב ניסיוני באורגניזמים מודל יונקים גבוהים יותר.
במהלך השנים האחרונות, תשומת הלב הציבורית התמקדה קנבינואידים בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהם, כולל טיפול באפילפסיה1, מחלת פרקינסון2, טרשת נפוצה3, וצורות שונות של סרטן4,5,6 עם קנבידיול (CBD). מכיוון שקנאביס הופך לחוקי כסחורה חקלאית בחוק השיפור החקלאי של 2018, החוק הציבורי 115-334 (חוק החוות לשנת 2018), הקנאביס ונגזרותיו הקנבינואידיות בתעשיות המזון, הקוסמטיקה והתרופות גדלו באופן אקספוננציאלי. בנוסף, מבודדים קליניים של קנבינואידים בודדים ותערובות קנבינואידים נבדקו בהצלחה בנבדקים אנושיים7, קווי תאים5,8, ומערכות מודל בעלי חיים מגוונות9,10.
ניסוי קליני יהיה אידיאלי לאימות היעילות וההשפעות השליליות של קנבינואידים על מחלה ספציפית. עם זאת, ישנם אתגרים רבים בניסויים קליניים, כולל אישור אתי/ IRB, גיוס ושימור הנבדקים11. כדי להתגבר על משוכות אלה, נעשה שימוש בקווי תאים אנושיים שונים מכיוון שקווי תאים שמקורם בבני אדם הם חסכוניים, קלים לטיפול, יכולים לעקוף את הבעיות האתיות, ולספק תוצאות עקביות וניתנות לשחזור מכיוון שקווי התאים הם ‘אוכלוסייה טהורה של תאים שאין להם זיהום צולב של תאים וכימיקלים אחרים’12.
Alves et al. (2021)13 נבדק CBD באופן תלוי במינון ב trophoblasts השליה, שהם תאים מיוחדים של השליה הממלאים תפקיד חיוני השתלת עובר ואינטראקציה עם הרחם האימהי החליט14. התוצאות שלהם הראו כי CBD גרם לאובדן הכדאיות התא, הפרעה בהתקדמות מחזור התא, אינדוקציה אפופטוזיס. תצפיות אלה ממחישות את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של שימוש בקנביס על ידי נשים בהריון13. כמו כן, סדרה של קווי תאים שימשו גם כדי לבחון את ההשפעות הפרמקולוגיות של CBD במחלות אנושיות, בפרט, צורות שונות של סרטן. מחקרי הפריה חוץ גופית הדגימו בהצלחה השפעות אנטי סרטניות בתאי סרטן הלבלב15, השד8 וסרטן המעי הגס16. עם זאת, בעוד להיות זמין נרחב וקל לטפל, קווי תאים ספציפיים כגון HeLa, HEK293 נוטים לשינויים גנטיים פנוטיפיים עקב שינויים בתנאי הצמיחה שלהם או טיפול17.
במחקר קנאביס, מערכות מודל בעלי חיים שונות, החל בעלי חיים קטנים כגון עכבר18, שפן ניסיונות19, ארנב19 כדי בעלי חיים גדולים כגון כלב20, חזירון21, monkey22, horse23, שימשו כדי לחקור השפעות טיפוליות לא ידועות. עכברים היו מערכת מודל בעלי החיים המועדפת ביותר לחקר קנבינואידים בשל הדמיון האנטומי, הפיזיולוגי והגנטי שלהם לבני אדם24. והכי חשוב, לעכברים יש קולטני CB1/2 במערכת העצבים שלהם, שנמצאים בבני אדם. יש להם גם מחזור חיים קצר יותר מאשר נבדקים אנושיים, עם תחזוקה קלה יותר ומשאבים גנטיים בשפע, ובכך להקל בהרבה על ניטור ההשפעות של קנבינואידים לאורך מחזור חיים שלם. מערכת היונקים נמצאת בשימוש נרחב והוכיחה בהצלחה כי CBD מקל על הפרעות פרכוסים1, הפרעת דחק פוסט טראומטית9, כיבים אוראליים25, ותסמינים דמויי דמנציה10. מודל העכבר אפשר גם מחקר אינטראקציה חברתית של אנשים בתוך קהילה אשר קשה מאוד בבעלי חיים גדולים ובני אדם26.
למרות כל היתרונות של מערכת מודל בעלי חיים, זה עדיין יקר ודורש טיפול נמרץ במהלך מתן תרופות ואיסוף נתונים. בנוסף, יש בדיקה של שימוש בעכברים במחקר בגלל חוסר הדדיות ו recapitulation לקוי של התנאים האנושיים בשל מגבלות בתכנון ניסיוני והקפדה27.
עם הביקוש הגובר למחקרים רפואיים/פרה-קליניים של קנבינואידים, יש צורך במערכת מודלים שאינם יונקים. מודלים חסרי חוליות העניקו באופן מסורתי יתרונות ייחודיים על פני מודלים בעלי חוליות. היתרונות המשמעותיים כוללים את הקלות והעלות הנמוכה של גידול דגימות רבות ומאפשר לחוקרים לעקוב אחר דורות רבים של אוכלוסיות הומוגניות גנטית28. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח את זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, להיות מערכת מודל חרקים יעיל לחקור פונקציות פרמקולוגיות של קנבינואידים מווסת התנהגויות האכלה29. בין מערכות מודל החרקים, המחברים התמקדו בתולעת הטבק, Manduca sexta, הידועה גם בשם עש ספינקס קרולינה או עש נץ, כמערכת מודל חרקים חדשנית למחקר קנבינואידים.
סקסטה מנדוקה שייכת למשפחתו של ספינגידיי. החרק הוא מזיק הצמח הנפוץ ביותר בדרום ארצות הברית, שם הם ניזונים מצמחים סולניים. למודל החרקים היסטוריה ארוכה במחקרים בפיזיולוגיה של חרקים, ביוכימיה, נוירוביולוגיה ומחקרי אינטראקציה עם סמים. תיק המחקר של מנדוקה סקסטה כולל טיוטת רצף גנום, המאפשר הבנה ברמה המולקולרית של תהליכים תאיים חיוניים30. יתרון מכריע נוסף של מערכת מודל זו הוא גודלו הגדול, להגיע יותר מ 100 מ”מ אורך ו 10 גרם במשקל ב 18-25 ימים של התפתחות זחל. הגודל הגדול מאפשר לחוקרים לעקוב בקלות אחר שינויים מורפולוגיים והתנהגותיים בזמן אמת בתגובה לטיפול CBD. כמו כן, בשל הגודל, נבדקו תגובות אלקטרופיזיולוגיות עם מערכת העצבים בבטן, כולל גרעינים שנותחו מהזחלים ללא הגדרות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. התכונה הייחודית מאפשרת לחוקרים לחקור בקלות תגובות חריפות וארוכות טווח לקנבינואידים המנוהלים.
למרות רב-תכליתיות כזו, M. sexta רק לאחרונה נחקרה על התאמתה כמודל ניסיוני למחקרי קנאביס וקנבינואידים. בשנת 2019, המחברים השתמשו לראשונה במערכת מודל החרקים כדי להתייחס להשערה כי קנאביס התפתח לייצר קנבידיול כדי להגן על עצמו מפני אוכלי עשב חרקים30,31. התוצאה הראתה בבירור כי הצמחים ניצלו CBD כגורם מרתיע האכלה ועיכבו את הצמיחה של חרק המזיקים M. sexta זחל, כמו גם גרימת תמותה מוגברת31. המחקר הדגים גם את ההשפעות המצילות של CBD לזחלי אתנול שיכורים, וזיהה את ההשפעה הפוטנציאלית של הרכב של אתנול כנשא של CBD. כפי שמוצג, מערכת מודל החרקים חקרה ביעילות את ההשפעות הטיפוליות של קנבינואידים בתוך 3-4 שבועות עם פחות עבודה ועלויות מאשר מערכות בעלי חיים אחרות. למרות מודל החרקים חסר קולטני קנבינואידים (כלומר, אין קולטני CB1/2), מערכת המודל מספקת כלי בעל ערך להבנת התפקידים הפרמקולוגיים של קנבינואידים באמצעות קולטן קנבינואידים באופן עצמאי.
מחברי המחקר הזה עבדו בעבר עם תולעת קרן הטבק כמערכת מודל למחקר קנבינואידים31. לאחר בחינה מדוקדקת של היתרונות והסיכונים של שימוש ב- M. sexta, סיפקנו שיטה המערבת טיפול נכון והכנה של דיאטה לניסויים פרה-קליניים המאפשרים הזדמנויות לשימוש עתידי במעבדה פרה-קלינית.
מחקר ההאכלה הראה כי מינונים גבוהים של CBD (2 מ”מ) עיכבו את צמיחת החרק והגדילו את התמותה31. מודל החרקים הראה גם רגישות לאתנול; עם זאת, CBD למעשה detoxicated רעילות האתנול, הגדלת שיעור ההישרדות שלהם, צריכת דיאטה, והתנהגויות חיפוש מזון לרמות דומות לקבוצת הביקורת (איור 3A,B</…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי המכון לחקר הקנאביס באוניברסיטת קולורדו סטייט-פואבלו ומשרד המדע וה- ICT (2021-DD-UP-0379), ועיר צ’ונצ’און (קנבוס מו”פ ותיעוש, 2020-2021).
Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |