Det nuvarande protokollet ger instruktionsinformation för användning av tobakshornmask Manduca sexta i cannabinoidforskning. Metoden som beskrivs här innehåller alla nödvändiga förnödenheter och protokoll för att övervaka fysiologiska och beteendemässiga förändringar av insektsmodellen som svar på cannabidiol (CBD) behandling.
Med ökad uppmärksamhet på cannabinoider i medicin har flera däggdjursmodellorganismer använts för att klargöra sina okända farmaceutiska funktioner. Många svårigheter kvarstår dock inom däggdjursforskningen, vilket kräver utveckling av icke-däggdjursmodellorganismer för cannabinoidforskning. Författarna föreslår tobak hornworm Manduca sexta som ett nytt insektsmodellsystem. Detta protokoll ger information om att förbereda den konstgjorda kosten med olika mängder cannabidiol (CBD), inrätta en odlingsmiljö och övervaka deras fysiologiska och beteendemässiga förändringar som svar på CBD-behandling. Kort, efter att ha fått hornworm ägg, ägg tilläts 1-3 dagar vid 25 °C på en 12:12 ljus-mörk cykel att kläcka innan de slumpmässigt fördelas i kontroll (vete groddar-baserade konstgjorda kost; AD), fordon (AD + 0,1% medelkedjig triglyceridolja; MCT-olja) och behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). När mediet var förberett placerades 1: a instar larver individuellt i ett 50 ml provrör med en träspettpinne, och sedan var provröret täckt med en ostduk. Mätningar gjordes i 2-dagars intervall för fysiologiska och beteendemässiga svar på CBD-administrationen. Detta enkla odlingsförfarande gör det möjligt för forskare att testa stora exemplar i ett givet experiment. Dessutom gör de relativt korta livscykeln det möjligt för forskare att studera effekten av cannabinoidbehandlingar över flera generationer av en homogen population, vilket möjliggör data för att stödja en experimentell design i högre däggdjursmodellorganismer.
Under de senaste åren har allmänhetens uppmärksamhet varit centrerad på cannabinoider på grund av deras terapeutiska potential, inklusive behandling av epilepsi1, Parkinsons sjukdom2, multipel skleros3 och olika former av cancer4,5,6 med cannabidiol (CBD). Eftersom Cannabis legaliseras som en jordbruksvara i Agricultural Improvement Act från 2018 har offentlig lag 115-334 (2018 Farm Bill), Cannabis och dess cannabinoidderivat inom livsmedels-, kosmetika- och läkemedelsindustrin ökat exponentiellt. Dessutom har isolat av enstaka cannabinoider och cannabinoidblandningar framgångsrikt testats hos människor7, cellinjer5,8 och olika djurmodellsystem9,10.
En klinisk prövning skulle vara idealisk för att validera effekten och de negativa effekterna av cannabinoider på en specifik sjukdom. Det finns dock många utmaningar i kliniska prövningar, inklusive etiskt/IRB-godkännande, rekrytering och kvarhållande av försökspersonerna11. För att övervinna dessa hinder användes olika mänskliga cellinjer eftersom mänskliga cellinjer är kostnadseffektiva, lätta att hantera, kan kringgå de etiska frågorna och ge konsekventa och reproducerbara resultat eftersom cellinjerna är en “ren population av celler som inte har någon korskontaminering av andra celler och kemikalier”12.
(2021)13 testade CBD på ett dosberoende sätt i placentatrofoblasterna, som är specialiserade celler i moderkakan som spelar en viktig roll i embryoimplantation och interaktion med dencidualiserade moderns livmoder14. Deras resultat visade att CBD orsakade celllivsförlust, störningar i cellcykelns progression och apoptosinduktion. Dessa observationer visar de potentiella negativa effekterna av cannabisanvändning av gravida kvinnor13. På samma sätt användes också en serie cellinjer för att undersöka de farmakologiska effekterna av CBD i mänskliga sjukdomar, i synnerhet olika former av cancer. In vitro-studierna visade framgångsrikt anti-cancer effekter i bukspottskörteln15, bröst8 och kolorektal cancerceller16. Men samtidigt som de är allmänt tillgängliga och lätta att hantera, är specifika cellinjer som HeLa, HEK293 benägna att genetiska och fenotypiska förändringar på grund av förändringar i deras tillväxtförhållanden eller hantering17.
I cannabisforskning har olika djurmodellsystem, allt från små djur som mus18, marsvin19 och kanin19 till stora djur som hund20, gris21, monkey22, häst23, använts för att utforska okända terapeutiska effekter. Möss har varit det mest föredragna djurmodellsystemet för cannabinoidforskning på grund av deras anatomiska, fysiologiska och genetiska likhet med människor24. Mest signifikant har möss CB1/2-receptorer i nervsystemet, som finns hos människor. De har också en kortare livscykel än människor, med enklare underhåll och rikliga genetiska resurser, vilket gör det mycket lättare att övervaka effekterna av cannabinoider under en hel livscykel. Däggdjurssystemet används ofta och har framgångsrikt visat att CBD lindrar anfallsstörningar1, posttraumatiskt stressyndrom9, munsår25 och demensliknande symtom10. Musmodellen har också möjliggjort en social interaktionsstudie av individer i ett samhälle som är extremt svårt hos stora djur och människor26.
Trots alla fördelar med djurmodellsystemet är det fortfarande kostsamt och kräver intensivvård under läkemedelsadministration och datainsamling. Dessutom finns det granskning av att använda möss i forskning på grund av irreproduktivitet och dålig rekapitulation av mänskliga förhållanden på grund av begränsningar i experimentell design och rigor27.
Med den ökande efterfrågan på medicinska/prekliniska studier av cannabinoider behövs ett icke-däggdjursmodellsystem. Ryggradslösa djurmodeller gav traditionellt distinkta fördelar jämfört med ryggradsdjursmodeller. De betydande fördelarna inkluderar den enkla och låga kostnaden för att föda upp många exemplar och göra det möjligt för forskare att övervaka flera generationer av genetiskt homogena populationer28. En ny studie visade att fruktflugan, Drosophila melanogaster, är ett effektivt insektsmodellsystem för att undersöka farmakologiska funktioner hos cannabinoider för att modulera utfodringsbeteenden29. Bland insektsmodellsystemen fokuserade författarna på tobakshornmasken, Manduca sexta, även känd som Carolina sfinxmoth eller hawk moth, som ett nytt insektsmodellsystem för cannabinoidforskning.
Manduca sexta tillhör familjen Sphingidae. Insekten är det vanligaste växtskadedjuret i södra USA, där de matar på solanaceous växter. Insektsmodellen har en lång historia inom forskning inom insektsfysiologi, biokemi, neurobiologi och läkemedelsinteraktionsstudier. Manduca sextas forskningsportfölj innehåller ett utkast till genomsekvens, vilket möjliggör en molekylär förståelse av viktiga cellulära processer30. En annan viktig fördel med detta modellsystem är dess stora storlek, som når mer än 100 mm i längd och 10 g i vikt under 18-25 dagars larvutveckling. Den stora storleken gör det möjligt för forskare att enkelt övervaka morfologiska och beteendemässiga förändringar i realtid som svar på CBD-behandlingen. På grund av storleken undersöktes också elektrofysiologiska svar med buk nervsystemet, inklusive ganglier dissekerade från larverna utan högupplösta mikroskopinställningar. Den unika funktionen gör det möjligt för forskare att enkelt undersöka akuta och långsiktiga svar på de administrerade cannabinoiderna.
Trots sådan mångsidighet har M. sexta nyligen utforskats för sin lämplighet som en experimentell modell för cannabis- och cannabinoidstudier. År 2019 använde författarna insektsmodellsystemet för första gången för att ta itu med hypotesen att Cannabis har utvecklats för att producera Cannabidiol för att skydda sig mot insekts växtätare30,31. Resultatet visade tydligt att växterna utnyttjade CBD som en utfodring avskräckande och hämmade tillväxten av skadedjuret M. sexta caterpillar, samt orsakade ökad dödlighet31. Studien visade också de räddande effekterna av CBD på berusade etanollarver och identifierade etanolens potentiella fordonseffekt som bärare av CBD. Som visats undersökte insektsmodellsystemet effektivt cannabinoidernas terapeutiska effekter inom 3-4 veckor med mindre arbete och kostnader än andra djursystem. Även om insektsmodellen saknar cannabinoidreceptorer (dvs. inga CB1/2-receptorer), ger modellsystemet ett värdefullt verktyg för att förstå cannabinoidernas farmakologiska roller genom ett cannabinoidreceptoroberoende sätt.
Författarna till denna studie har tidigare arbetat med tobakshornmasken som ett modellsystem för cannabinoidforskning31. Efter noggrant övervägande av fördelarna och riskerna med att använda M. sexta, har vi tillhandahållit en metod som innebär korrekt vård och förberedelse av kost för prekliniska prövningar som möjliggör möjligheter för framtida preklinisk laboratorieanvändning.
Utfodringsstudien visade att höga doser av CBD (2 mM) hämmade insektens tillväxt och ökad dödlighet31. Insektsmodellen visade också känslighet för etanol; CBD avtättade dock effektivt etanoltoxiciteten, vilket ökade deras överlevnadsgrad, kostkonsumtion och matsökningsbeteenden till liknande nivåer som kontrollgruppen (figur 3A, B)31. Det beskrivna insektsmodellsystemet består av tre kritiska steg: (1) se till att…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Institute of Cannabis Research vid Colorado State University-Pueblo och Ministry of Science and ICT (2021-DD-UP-0379) och Chuncheon City (Hemp R&D och industrialization, 2020-2021).
Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |