JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Genética

ACT1-CUP1-analyser bestemmer substratspesifikke følsomheter for spliceosomale mutanter i spirende gjær

Published: June 30, 2022
doi:
10.3791/63232
1College of Arts and Sciences,Northwest University

Summary

ACT1-CUP1-analysen, en kobbervekstanalyse, gir en rask avlesning av forløperen messenger RNA (pre-mRNA) spleising og virkningen mutant spleisingsfaktorer har på spliceosomal funksjon. Denne studien gir en protokoll og fremhever tilpasningen som er mulig for å løse spleisingsspørsmålet av interesse.

Abstract

Mutasjoner introdusert i spliceosomet eller dets substrat har betydelig bidratt til vår forståelse av vanskelighetene med spliceosomal funksjon. Enten sykdomsrelatert eller funksjonelt valgt, har mange av disse mutasjonene blitt studert ved hjelp av vekstanalyser i modellorganismen Saccharomyces cerevisiae (gjær). Den spleisespesifikke kobbervekstanalysen, eller ACT1-CUP1-analysen, gir en omfattende analyse av mutasjon på fenotypisk nivå. ACT1-CUP1-analysen bruker reportere som gir kobbertoleranse når de er riktig skjøtet. Således, i nærvær av kobber, korrelerer endringer i gjærens levedyktighet med endringer i mRNA-produksjon gjennom spleising. I et typisk eksperiment utfordres gjærspliceosomet med forskjellige ikke-konsensus-spleisingsreportere og spleisingsfaktormutasjonen av interesse for å oppdage synergetisk eller antitetisk innvirkning på spleising. Her gis en fullstendig beskrivelse av kobberplatepreparasjon, plating av gjærceller og dataevaluering. Et utvalg av komplementære eksperimenter er beskrevet, og fremhever allsidigheten til ACT1-CUP1-reporterne. ACT1-CUP1-analysen er et praktisk verktøy i spleiseverktøykassen takket være direkte avlesning av mutasjonseffekt(er) og de komparative mulighetene fra fortsatt bruk i felt.

Introduction

Spliceosomet er en stor, biologisk maskin som katalyserer fjerning av introner, ikke-kodende regioner i forløperen messenger RNA (pre-mRNA)1,2. Karakterisering av effekten av en enkeltpunktsmutant i 1 av de nesten 100 proteiner og 5 ikke-kodende RNA er ofte tvetydig når man studerer proteinet eller RNA isolert. Endringen i den muterte komponentens funksjon kan best evalueres in vivo i sammenheng med det fulle, fungerende spliceosomet.

Kobbervekstanalysen beskrevet her er en rask måling av spleisingseffektivitet i Saccharomyces cerevisiae eller spirende gjær. Utviklet av CF Lesser og C. Guthrie og publisert i 1993, kombinerer denne analysen det enkle å jobbe med en enkel modellorganisme og den enkle avlesningen av cellens levedyktighet3. Levedyktigheten korrelerer med hvor godt spliceosomene i disse cellene kan gjenkjenne og spleise reporterutskriften.

Denne kobbervekstanalysen kalles mer vanlig ACT1-CUP1-analysen. Navnet ACT1-CUP1 stammer fra de to genene smeltet sammen for å skape en reporter av spleiseeffektivitet. ACT1 er gjærens aktingen, som er sterkt uttrykt og har en effektivt skjøtet intron 4,5. Cup1p er en kobberkelator som sekvestrerer kobber i cellen for å forhindre interferens med vanlige cellulære funksjoner 6,7,8. ACT1-CUP1-reporteren inneholder disse genene i rekkefølge slik at CUP1 bare er i riktig leseramme hvis pre-mRNA-spleising av ACT1s intron forekommer (figur 1). Det resulterende fusjonsproteinet inneholder de første 21 aminosyrene av aktin og full lengde Cup1p-protein, noe som øker gjærens levedyktighet i et kobberrikt miljø3. Dermed resulterer en økning i mengden spleising av reporteren i en høyere konsentrasjon av Cup1p og en høyere kobbermotstand (figur 1). Sammenlignet med andre reportergener, påvirker CUP1 cellens levedyktighet selv ved lave nivåer, har et bredt følsomhetsområde, og kan brukes til å velge direkte for spleising av mutasjoner 3,6,7. I tillegg er CUP1 ikke avgjørende for standard gjærvekst, og dermed påvirkes ikke cellulær homeostase under oppsettet for denne analysen. I tillegg til slettings- eller temperaturvekstanalyser gir ACT1-CUP1 informasjon om effekten på skjøting under ellers optimale gjærvekstforhold.

Spliceosomet gjenkjenner substratet gjennom tre introniske sekvenser, nemlig 5′ spleisestedet (5′ SS), grenstedet (BS) og 3′ spleisestedet (3′ SS). Tallrike ACT1-CUP1-reportere har blitt generert som inneholder ikke-konsensussekvenser på disse nettstedene. Et utvalg av de vanligste ACT1-CUP1-reporterne er vist i figur 1 og tabell 1. Ettersom spliceosomet samhandler med hvert skjøtested unikt på forskjellige punkter i spleisingssyklusen, kan robustheten til spliceosomet testes på forskjellige trinn basert på hvilken ikke-konsensusreporter som brukes. Ikke-konsensusreportere er oppkalt etter den muterte posisjonen i intronen og basen den ble mutert til. For eksempel er A3c en reporter med en mutasjon ved 5 ‘SS, spesielt posisjon 3 fra konsensus adenosin til en cytosin. Denne reporteren vil samhandle sterkt med spliceosome mutasjoner som påvirker 5 ‘SS utvalg og bruk. I sin første studie bestemte Lesser og Guthrie hvilke 5 ‘SS-mutasjoner som hemmet spleising3. Senere samme år ble ikke-konsensusreportere på alle tre spleisestedene publisert av Burgess og Guthrie i en suppressorskjerm av mutasjoner i ATPase Prp16p9. Ved å sammenligne konsensus med ikke-konsensusreportere, har ACT1-CUP1-analysen vært en viktig nøkkel til å forstå robustheten og selektiviteten til gjærspleisosomet og å utlede funksjonen til andre eukaryoters spliceosomer.

Som ikke-konsensus ACT1-CUP1-reportere sensibiliserer spliceosomet til ytterligere forstyrrelse, kan virkningen av en enkelt spleisingsfaktormutasjon karakteriseres gjennom reporterne det positivt eller negativt påvirker. Dette har blitt brukt til å skjøte forskningsspørsmål på en rekke måter. For det første kan og har ACT1-CUP1-analysen blitt brukt som en genetisk skjerm for mutasjoner i spleisingsfaktorer. For eksempel fungerer Prp8p, det største spleisingsproteinet, som en plattform hvor RNA-kjernen i spliceosomet katalyserer spleisingsreaksjonen. Dette ble delvis utledet gjennom hvordan Prp8p-mutanter forbedret eller reduserte spleisingen av forskjellige ACT1-CUP1-reportere 10,11,12,13,14,15,16,17. Andre proteinkomponenter i spliceosomet har også blitt undersøkt ved bruk av ACT1-CUP1, inkludert Hsh155p, Cwc2p, Cef1p og Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energiske tersklene for Prp16p og fire andre ATPaser involvert i spliceosomal overgang har også blitt studert med denne analysen 9,26,27,28,29,30. De små nukleære RNA-ene (snRNA-ene) har også blitt grundig studert ved bruk av ACT1-CUP1 for å identifisere pre-mRNA-sekvensene de koordinerer og endringene i sekundærstrukturen snRNA-ene gjennomgår under spleising3,31,32,33,34,35,36,37.

ACT1-CUP1-analysen krever en gjærstamme der alle kopier av CUP1-genet er slått ut. Siden CUP1 kan ha et høyt kopinummer 6,38, kan forberedelse av en full knock-out-belastning kreve flere runder eller omfattende screening. Som et resultat har cup1Δ gjærstammer ofte blitt delt mellom laboratorier, som har reporterne.

Hvis mutasjon(er) i en spleisingsfaktor vurderes fra en plasmidkopi, bør villtypegenet for denne faktoren slås ut. I tillegg bør gjærbakgrunnen tillate seleksjon av minst to plasmider, en som inneholder en ACT1-CUP1-reporter, historisk på et leucin næringsstoffseleksjonsplasmid, og en som inneholder en mutasjon eller forstyrrelse i spleisingsmaskineriet som skal studeres (figur 2). Vanligvis, i en enkelt analyse, vil flere gjærstammer, som hver bærer spørringen splicing perturbation (QSP) og en annen reporter, teste spørringens innvirkning på spleising.

De uavhengige variablene i ACT1-CUP1-analysen tillater en forsker å vurdere alvorlighetsgraden av en QSP. Disse uavhengige variablene er konsentrasjonen av kobber og utvalget av flere ikke-konsensus spleising reportere. For det første, ettersom gjærstammene dyrkes på plater som inneholder en rekke kobberkonsentrasjoner (figur 2), inkluderer oppsettet av analysen å velge gradienten av konsentrasjoner som brukes. Studier kan bruke et kurs kobberkonsentrasjonsgradient for å få en innledende avlesning av levedyktighet og deretter gjenta analysen med en finere gradient for å identifisere subtile levedyktighetsforskjeller. Den andre variabelen er det brede spekteret av ACT1-CUP1-reportere som er mulig å teste (figur 1 og tabell 1). Hvis QSP påvirker gjærens levedyktighet annerledes i nærvær av en ikke-konsensusreporter versus villtype, kan det konkluderes med at QSP påvirker et trinn i spleising eller en region av spliceosomet som er viktig under anerkjennelsen eller behandlingen av den regionen av intronen.

Gjærverktøykassen er omfattende, og ACT1-CUP1-analysen er en integrert del av skjøteforskningen. ACT1-CUP1-analysen utføres ofte sammen med en mer grundig genetisk, strukturell og / eller biokjemisk analyse av virkningen av en QSP. Siden disse mer detaljerte studiene generelt har en lengre prosedyre og/eller høyere prislapp, er en hyppig tilnærming screening for interessante mutanter med ACT1-CUP1 først.

Forutsatt her er en ACT1-CUP1 analyseprotokoll, inkludert kobberplateforberedelse. Denne analysen gir forskere et første svar på QSPs effekt på spleising og hvilke introniske regioner som er mest påvirket av forstyrrelsen.

Protocol

1. Gjærstammekonstruksjon Generer eller oppnå en S. cerevisiae-stamme hvis bakgrunn inkluderer leu2 og cup1Δ. For å generere denne bakgrunnen, bruk den veletablerte gjærmetoden som bruker litiumacetat og enkeltstrenget DNA39.MERK: Haploide gjærstammer kan inneholde en, to eller flere kopier av CUP1 6,38. Se genomisk informasjon for den valgte gjærstammen når du desi…

Representative Results

Vekstanalyser, som ACT1-CUP1, krever visuell, komparativ vurdering av flere kolonier. Her ble hver stamme dyrket til metning over natten, fortynnet til en OD600 på 0,5, og belagt på 20 plater som inneholdt en rekke kobberkonsentrasjoner fra 0 mM til 1,1 mM CuSO4 (figur 3). Dette området er mindre enn det som er oppført i protokollen, da det tillot full vurdering av virkningen av QSP-ene og ACT1-CUP1-reporterne som brukes og beskrives nedenfor. Platene ble avbildet o…

Discussion

ACT1-CUP1 er en vekstanalyse, og det må tas hensyn til at observerte vekstforskjeller kun kan tilskrives skjøtefeil. Alle belastninger skal håndteres på lignende måte før plating, inkludert å ha en lignende lengde og type vekst og lagringsforhold. Hvis du bruker temperaturfølsomme stammer, bør ACT1-CUP1-analyser bare utføres under forhold der disse stammene vokser sammenlignbart med villtype. Tilsvarende, for QSP-komponenten, anbefales det å ha identiske gjærbakgrunner og ekspresjonsnivåer av QSP-gen (er) fo…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Takk til Aaron Hoskins og Hoskins lab medlemmer ved University of Wisconsin-Madison for bruk av gjær stammer og utstyr i genereringen av tallene 3-5. Takk til Harpreet Kaur og Xingyang Fu for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet. Takk til støttende studenter, ansatte og fakultet ved Northwest University under skriving, redigering og filming av dette papiret. Takk til Isabelle Marasigan for hjelp til å filme denne metoden.

Materials

1.5 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129 Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-138 Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 07-201-332 Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate Fisher Scientific 07-200-760 Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol Fisher Scientific 22-032-600 Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm) CellTreat Scientific Products 229707 Or comparable item from a different manufacturer.
Agar Fisher Scientific BP1423-500 Any molecular grade agar will work.
Autoclave Tuttnauer 3870EA Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner Humboldt PN6200.1 Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter VWR 490005-906 Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate Fisher Scientific LC134051 Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system Cytiva 29399481 ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu) USBiological Life Sciences D9525 Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose Fisher Scientific AAA1682836 Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software Cytiva 29-0006-05 ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera Nikon D3500 Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device Cytiva 29238583 Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp Fisher Scientific 05-769-7Q Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp Fisher Scientific 12-000-101 Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-51 Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator VP Scientific VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes VWR 97000-590 Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker JEIO Tech IST-3075 Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer Biowave 80-3000-45 Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates VWR 102091-156 Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate Fisher Scientific 11-520-16S Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base USBiological Life Sciences Y2025 Or comparable item from a different manufacturer.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genética. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3′ splice site selection. Genética. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5′ splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O’Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5′ splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816 (2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Tags

ACT1-CUP1 AssayPre-messenger RNA SplicingSplicing Factor MutationGrowth PhenotypeLeucine Dropout Growth MediaCopper SulfateOptical DensitySpectrophotometerDilutionBunsen BurnerReplicator
check_url/pt/63232?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (184), e63232, doi:10.3791/63232 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image