Masseproduktion af entomopatogene svampe, Metarhizium robertsii og Metarhizium pinghaense til kommerciel anvendelse mod skadedyr

Summary

Entomopatogene svampe har fået betydning som biologiske bekæmpelsesmidler for skadedyr i landbruget. I denne undersøgelse blev masseproduktionen af et tilstrækkeligt antal elastiske infektivende propaguler af sydafrikanske isolater af både Metarhizium robertsii og M. pinghaense til kommerciel anvendelse mod skadedyr med succes udført ved anvendelse af landbrugskornprodukter.

Abstract

Entomopatogene svampe i Metarhizium anisopliae artskomplekset har fået betydning som de biologiske bekæmpelsesmidler for landbrugsinsektskadedyr. Stigningen i skadedyrsresistens over for kemiske insekticider, den voksende bekymring over insekticidernes negative virkninger på menneskers sundhed og miljøforureningen fra pesticider har ført til en global indsats for at finde nye bæredygtige strategier for afgrødebeskyttelse og skadedyrsbekæmpelse. Tidligere er forsøg på at massekulturere sådanne entomopatogene svampe (EPF) arter som Beauveria bassiana blevet udført. Der er dog kun gjort begrænsede forsøg på at massedyre Metarhizium robertsii og M. pinghaense til brug mod skadedyr. Denne undersøgelse havde til formål at masseproducere et tilstrækkeligt antal modstandsdygtige infektiøs propaguler af sydafrikanske isolater af M. robertsii og M. pinghaense til kommerciel anvendelse. Tre landbrugskornprodukter, flager havre, flager byg og ris, blev brugt som EPF faste gæringssubstrater. To podningsmetoder, konidiale suspensioner og den flydende svampekultur af blastosporer blev brugt til at inokulere de faste substrater. Inokulation ved hjælp af konidiale suspensioner blev observeret at være relativt mindre effektiv, da der blev observeret øgede niveauer af kontaminering på de faste substrater i forhold til ved anvendelse af blastospore-podningsmetoden. Flaget havre viste sig ikke at være et egnet vækstsubstrat for både M. robertsii og M. pinghaense, da der ikke blev høstet tørre conidier fra substratet. Flaked byg viste sig at favorisere produktionen af M. robertsii conidia frem for M. pinghaense, og et gennemsnit på 1,83 g ± 1,47 g tør M. robertsii conidia og nul gram M. pinghaense conidia blev høstet fra substratet. Riskorn viste sig at favorisere den konidiale masseproduktion af både M. pinghaense og M. robertsii isolater, med et gennemsnit på 8,2 g ± henholdsvis 4,38 g og 6 g ± 2 g høstet fra substratet.

Introduction

Entomopatogene svampe (EPF) har fået betydning som plantebeskyttelsesmidler i den biologiske bekæmpelse af vigtige landbrugsinsektskadegørere ^1,2. Entomopatogenerne, som forekommer naturligt i jorden, forårsager epizootier i populationerne af forskellige skadedyrsarter³. EpF-arterne er værtsspecifikke og udgør relativt få risici med hensyn til at angribe ikke-målarter, og de er ugiftige for miljøet⁴. EPF har en unik mekanisme til at invadere deres vært samt til at udbrede og fortsætte i deres umiddelbare miljø¹. De angriber værten hovedsageligt gennem aseksuelle sporer, der fastgøres til og trænger ind i værtskutiklen for at invadere og sprede sig i værtshæmokølen. Værten dør til sidst på grund af udtømning af hæmolymfenæringsstofferne eller som følge af toksæmi forårsaget af de toksiske metabolitter frigivet af svampen. Efter døden, under ideelle miljøforhold, fremkommer svampen på den ydre overflade (åbenlys mykose) af værtskadaveren ^5,6.

Voksende bekymring over de negative virkninger af kemiske rester på menneskers sundhed, miljøforurening og udviklingen af skadedyrsresistens har ført til den globale indsats for at reducere input af kemisk baserede insekticider og finde alternative, nye og bæredygtige strategier for afgrødebeskyttelse og skadedyrsbekæmpelse ^6,7,8 . Dette har givet mulighed for at udvikle mikrobielt baserede insekticider til brug i Integrated Pest Management (IPM) programmer, som er mere økologisk gunstige strategier end konventionel kemisk bekæmpelse ^3,8.

For at udvikle et vellykket mikrobielt bekæmpelsesmiddel til et landbrugsskadegører skal en egnet organisme først isoleres, karakteriseres, identificeres og dens patogenicitet for målskadegøreren bekræftes. Der kræves imidlertid en nem og omkostningseffektiv metode til storskalaproduktion af det mikrobielle agens for at fremstille et levedygtigt produkt til brug i biologiske bekæmpelsesprogrammer 9,10,11,12,13. Masseproduktion af betydelige mængder entomopatogener af god kvalitet afhænger af den mikrobielle stamme, miljøet, målskadegøreren, formuleringen, markedet, anvendelsesstrategien og det ønskede slutprodukt 14,15,16. EPF kan masseproduceres ved hjælp af flydende substratfermentering til fremstilling af blastosporer eller fermenteringsprocessen for fast substrat til fremstilling af luftkonidier ^6,17,18. Masseproduktions- og formuleringsprocessen af entomopatoggener påvirker imidlertid direkte virulensen, omkostningerne, holdbarheden og felteffektiviteten af slutproduktet. For en vellykket anvendelse i IPM skal produktionsprocessen for entomopatogerne være let at køre, kræve minimal arbejdskraft, producere en høj udbyttekoncentration af virulente, levedygtige og vedvarende propaguler og være lav i omkostninger 4,13,14,16.

Forståelse af de ernæringsmæssige behov for entomopatogener er vigtig for massedyrkning med alle dyrkningsmetoder ^4,12. De ernæringsmæssige komponenter i produktionsmediet har en betydelig indvirkning på egenskaberne ved de resulterende propaguler, herunder biokontroleffektivitet, udbytte, udtørringstolerance og persistens 8,19,20,21. Optimeringen af produktionsprocedurerne er designet til at imødegå sådanne faktorer²². For EPF er de vigtigste krav til god vækst, sporulation og masseproduktion af svampekonidier tilstrækkelig fugtighed, optimal væksttemperatur, pH, gasudveksling af CO₂ og_O2 og ernæring, herunder gode fosfor-, kulhydrat-, kulstof- og nitrogenkilder¹⁸.

Jaronski og Jackson¹⁸ beskriver fermenteringsmetoden med fast substrat som den mest effektive og tætteste tilnærmelsesmetode til den naturlige proces til EPF-produktion i forhold til fermenteringsmetoden for flydende substrat, fordi svampekonidiumet under naturlige forhold bæres på faste oprejste strukturer, som overfladen af insektkadavere. Landbrugsprodukter og biprodukter, der indeholder stivelse, anvendes for det meste til masseproduktion af hypokrealeanske svampe, da svampene let nedbryder stivelse gennem udskillelse af stærkt koncentrerede hydrolytiske enzymer fra deres bindestregsspidser, for at trænge ind i det faste stof og for at få adgang til de næringsstoffer, der er til stede i stoffet 11,17,18,23 . Kornprodukterne stiller også krav til sund biomasseproduktion, fordi substraterne, når de hydreres og steriliseres, kan optage yderligere næringsstoffer fra ethvert flydende medium 16,18,24.

Tidligere forsøgte flere undersøgelser at massekulturere EPF-arter som Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas og nogle af Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin artskompleks isolerer på forskellige substrater 16,23,24. Sådanne masseproducerede og kommercielt udviklede isolater omfatter Green Muscle^® (stamme IMI 330189), udviklet fra M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 stamme ICIPE69) og Real Metarhizium 69 (L9281), udviklet fra M. anisopliae, og bredbånd^® (stamme PPRI 5339) og Eco-Bb^®, udviklet fra B. bassiana^25,26 . Der er dog gjort begrænsede forsøg på massekultur Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber og Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Disse to isolater blev udvalgt i en tidligere undersøgelse som de mest effektive til bekæmpelse af mælkebuggen, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. Derfor havde den nuværende undersøgelse til formål at formulere og masseproducere et tilstrækkeligt antal modstandsdygtige infektiøs propaguler af de lokale isolater af M. robertsii og M. pinghaense til kommerciel anvendelse mod skadedyr. Den faste substratfermenteringsmetode blev brugt til at masseproducere svampekonidierne for begge EPF-isolater. To EPF-podningsmetoder ved anvendelse af konidiale suspensioner og den flydende svampekultur af blastosporer blev anvendt til at inokulere de faste substrater.

Protocol

1. Kilde til svampestammer Brug sydafrikanske isolerede svampestammer af både M. pinghaense 5 HEID (GenBank tiltrædelsesnummer: MT367414/ MT895630) og M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), indsamlet fra æbleplantager i Western Cape-provinsen, Sydafrika. Dyrkningskulturer af hvert EPF-isolat på 60 g Sabouraud dextrose agar medium, suppleret med 1 g gærekstrakt (SDAY) og 10 μL Streptomycin.BEMÆRK: Inkuber EPF-kulturer ved en kontrolleret temperat…

Representative Results

Et fald i indholdsmassen af kulturerne på ris for både M. pinghaense og M. robertsii blev observeret over tid under tørringsfasen af svampekulturerne, hvor der ikke blev observeret nogen eller lidt ændring i massen, når kulturerne var tørre (figur 5). Det høstede tørre svampekonidierpulver fra både M. pinghaense og M. robertsii er vist i figur 6. <img alt="F…

Discussion

Den vellykkede integration af mikrobielle agenser til biologisk bekæmpelse af vigtige landbrugsinsektskadegørere i et agroøkosystem afhænger af både succes og let masseproduktion af entomopatogenerne som det første skridt under laboratorieforhold. Masseproduktionen af EPF er vigtig for den store anvendelse og tilgængelighed af EPF-produkter til IPM-programmer, der bruger biologisk kontrol 9,10,11,12,13.<sup cla…

Materials

0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia