Массовое производство энтомопатогенных грибов Metarhizium robertsii и Metarhizium pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей

Summary

Энтомопатогенные грибы приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. В данном исследовании было успешно проведено массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов как Metarhizium robertsii , так и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей с использованием сельскохозяйственных зерновых продуктов.

Abstract

Энтомопатогенные грибы видового комплекса Metarhizium anisopliae приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. Повышение устойчивости вредителей к химическим инсектицидам, растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия инсектицидов на здоровье человека и загрязнение окружающей среды пестицидами привели к глобальному стремлению найти новые устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями. Ранее предпринимались попытки массовой культивации таких энтомопатогенных видов грибов (EPF), как Beauveria bassiana . Однако были предприняты лишь ограниченные попытки массового культивирования Metarhizium robertsii и M. pinghaense для использования против насекомых-вредителей. Это исследование было направлено на массовое получение достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения. Три сельскохозяйственных зерновых продукта, слоеный овес, шелушащийся ячмень и рис, были использованы в качестве твердых ферментационных субстратов EPF. Для инокуляции твердых субстратов использовали два метода инокуляции, конидиальные суспензии и жидкую грибковую культуру бластоспор. Было отмечено, что инокуляция с использованием конидиальных суспензий была относительно менее эффективной, поскольку на твердых субстратах наблюдались повышенные уровни загрязнения по сравнению с использованием метода инокуляции бластоспор. Было обнаружено, что шелушащийся овес не является подходящим субстратом для роста как для M. robertsii , так и для M. pinghaense, поскольку с субстрата не собирали сухих конидий. Было обнаружено, что шелушеный ячмень благоприятствует производству M. robertsii conidia по сравнению с M. pinghaense, и в среднем из субстрата было собрано 1,83 г ± 1,47 г сухой M. robertsii conidia и ноль граммов M. pinghaense conidia. Было обнаружено, что рисовые зерна благоприятствуют конидиальному массовому производству изолятов M. pinghaense и M. robertsii , в среднем 8,2 г ± 4,38 г и 6 г ± 2 г, собранных из субстрата, соответственно.

Introduction

Энтомопатогенные грибы (EPF) приобрели важное значение в качестве средств защиты растений в биологической борьбе с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями ^1,2. Энтомопатогены, встречающиеся естественным образом в почве, вызывают эпизоотии в популяциях различных видов вредителей³. Виды EPF специфичны для хозяина и представляют относительно небольшой риск с точки зрения нападения на нецелевые виды, и они нетоксичны для окружающей среды⁴. EPF имеют уникальный механизм для вторжения в своего хозяина, а также для распространения и сохранения в их ближайшем окружении¹. Они атакуют хозяина в основном через бесполые споры, которые прикрепляются и проникают в кутикулу хозяина, чтобы вторгнуться и размножаться в гемокоэле хозяина. Хозяин в конечном итоге умирает из-за истощения питательных веществ гемолимфы или в результате токсикоза, вызванного токсичными метаболитами, выделяемыми грибком. После смерти, в идеальных условиях окружающей среды, грибок появляется на внешней поверхности (явный микоз) трупа хозяина ^5,6.

Растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия химических остатков на здоровье человека, загрязнения окружающей среды и развития устойчивости к вредителям привела к глобальному стремлению сократить потребление инсектицидов на химической основе и найти альтернативные, новые и устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями ^6,7,8 . Это предоставило возможности для разработки инсектицидов на основе микробов для использования в программах комплексной борьбы с вредителями (IPM), которые являются более экологически благоприятными стратегиями, чем обычный химический контроль ^3,8.

Чтобы разработать успешный микробный агент борьбы с сельскохозяйственным вредителем, подходящий организм должен быть сначала выделен, охарактеризован, идентифицирован и подтверждена его патогенность для целевого вредителя. Однако для получения жизнеспособного продукта для использования в программах биологического контроля ^{9,10,11,12,13} требуется простой и экономически эффективный метод крупномасштабного производства микробного агента. Массовое производство значительных количеств высококачественных энтомопатогенов зависит от микробного штамма, окружающей среды, целевого вредителя, состава, рынка, стратегии применения и желаемого конечного продукта 14,15,16. EPF может быть массово произведен с использованием ферментации жидкого субстрата для получения бластоспор или процесса ферментации твердого субстрата для получения воздушных конидий ^6,17,18. Однако процесс массового производства и рецептуры энтомопатогенов напрямую влияет на вирулентность, стоимость, срок годности и полевую эффективность конечного продукта. Для успешного использования в IPM процесс производства энтомопатогенов должен быть простым в эксплуатации, требовать минимальной рабочей силы, производить высокую концентрацию вирулентных, жизнеспособных и стойких пропагул и быть недорогим 4,13,14,16.

Понимание потребностей в питании энтомопатогенов важно для массового выращивания всеми методами культивирования ^4,12. Питательные компоненты производственной среды оказывают значительное влияние на характеристики полученных пропагул, включая эффективность биоконтроля, выход, устойчивость к высыханию и стойкость 8,19,20,21. Оптимизация производственных процедур предназначена для устранения таких факторов²². Для EPF основными требованиями для хорошего роста, споруляции и массового производства грибковых конидий являются достаточная влажность, оптимальная температура роста, рН, газообмен CO₂ и O₂ и питание, включая хорошие источники фосфора, углеводов, углерода и азота¹⁸.

Jaronski и Jackson¹⁸ описывают метод ферментации твердого субстрата как наиболее эффективный и наиболее близкий метод приближения к естественному процессу производства EPF по сравнению с методом ферментации жидкого субстрата, поскольку в естественных условиях грибковый конидиум переносится на твердые прямостоячие структуры, такие как поверхность трупов насекомых. Сельскохозяйственные продукты и побочные продукты, содержащие крахмал, в основном используются для массового производства гипокреальных грибов, поскольку грибы легко разлагают крахмал путем секреции высококонцентрированных гидролитических ферментов из своих гифальных кончиков, проникают в твердое вещество и получают доступ к питательным веществам, присутствующим в веществе ^11,17,18,23 . Зерновые продукты также обеспечивают требования для здорового производства биомассы, потому что, когда они гидратируются и стерилизуются, субстраты могут поглощать дополнительные питательные вещества из любой жидкой среды 16,18,24.

Ранее в нескольких исследованиях предпринимались попытки массового культивирования видов EPF, таких как Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Виегас и некоторые из Metarhizium anisopliae (Metschn.) Сорокинский видовой комплекс изолирует на различных субстратах 16,23,24. К таким массово производимым и коммерчески разработанным изолятам относятся Green Muscle^® (штамм IMI 330189), разработанный из M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 штамм ICIPE69), и Real Metarhizium 69 (L9281), разработанный из M. anisopliae, и Broadband^® (штамм PPRI 5339) и Eco-Bb^®, разработанный из B. bassiana^25,26 . Однако были предприняты ограниченные попытки массовой культуры Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber и Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Эти два изолята были выбраны в предыдущем исследовании как наиболее эффективные для борьбы с мучнистым червецом, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. Поэтому настоящее исследование направлено на формулирование и массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул местных изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей. Метод ферментации твердого субстрата был использован для массового получения грибковых конидий для обоих изолятов EPF. Два метода инокуляции EPF, с использованием конидиальных суспензий и жидкой грибковой культуры бластоспор, были использованы для инокуляции твердых субстратов.

Protocol

1. Источник грибковых штаммов Используйте южноафриканские изолированные грибковые штаммы как M. pinghaense 5 HEID (номер присоединения GenBank: MT367414/MT895630), так и M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), собранные из яблоневых садов в Западно-Капской провинции, Южная Африка. Выращива…

Representative Results

Снижение массы содержания культур на рисе как для M. pinghaense , так и для M. robertsii наблюдалось с течением времени во время стадии сушки грибковых культур, при этом никаких или незначительных изменений в массе наблюдалось после того, как культуры были сухими (рисунок 5…

Discussion

Успешная интеграция микробных агентов для биологической борьбы с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями в агроэкосистему зависит как от успеха, так и от простоты массового производства энтомопатогенов в качестве первого шага в лабораторных условиях. Массовое произво?…

Materials

0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia