Massaproductie van entomopathogene schimmels, Metarhizium robertsii pt Metarhizium pinghaense, voor commerciële toepassing tegen insectenplagen

Summary

Entomopathogene schimmels hebben aan belang gewonnen als de biologische bestrijders van landbouwinsectenplagen. In deze studie werd de massaproductie van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van Zuid-Afrikaanse isolaten van zowel Metarhizium robertsii als M. pinghaense voor commerciële toepassing tegen insectenplagen met succes uitgevoerd met behulp van landbouwproducten.

Abstract

Entomopathogene schimmels van het Metarhizium anisopliae soortencomplex hebben aan belang gewonnen als de biologische bestrijders van landbouwinsectenplagen. De toename van de resistentie tegen plagen tegen chemische insecticiden, de groeiende bezorgdheid over de negatieve effecten van insecticiden op de menselijke gezondheid en de milieuvervuiling door pesticiden hebben geleid tot een wereldwijde drive om nieuwe duurzame strategieën voor gewasbescherming en ongediertebestrijding te vinden. Eerder zijn pogingen gedaan om dergelijke entomopathogene schimmels (EPF) -soorten zoals Beauveria bassiana massaal te kweken. Er zijn echter slechts beperkte pogingen ondernomen om Metarhizium robertsii pt M. pinghaense massaal te kweken voor gebruik tegen insectenplagen. Deze studie was gericht op het massaal produceren van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van Zuid-Afrikaanse isolaten van M. robertsii pt M. pinghaense voor commerciële toepassing. Drie landbouwproducten, haver in vlokken, gerst in vlokken en rijst, werden gebruikt als de EPF vaste gistingssubstraten. Twee inentingsmethoden, conidiale suspensies en de vloeibare schimmelcultuur van blastospores werden gebruikt om de vaste substraten te enten. Inenting met behulp van conidiale suspensies bleek relatief minder effectief te zijn, omdat verhoogde niveaus van verontreiniging werden waargenomen op de vaste substraten ten opzichte van bij gebruik van de blastospore-inentingsmethode. Vlokken haver bleken geen geschikt groeisubstraat te zijn voor zowel M. robertsii als M. pinghaense, omdat er geen droge conidia uit het substraat werden geoogst. Vlokken gerst bleek de productie van M. robertsii conidia te bevoordelen boven die van M. pinghaense, en een gemiddelde van 1,83 g ± 1,47 g droge M. robertsii conidia en nul gram M. pinghaense conidia werd geoogst van het substraat. Rijstkorrels bleken de conidiale massaproductie van zowel M. pinghaense – als M. robertsii-isolaten te bevorderen, met een gemiddelde van respectievelijk 8,2 g ± 4,38 g en 6 g ± 2 g geoogst van het substraat.

Introduction

Entomopathogene schimmels (EPF) hebben aan belang gewonnen als gewasbeschermingsmiddelen in de biologische bestrijding van belangrijke landbouwinsectenplagen ^1,2. De entomopathogenen, die van nature in de bodem voorkomen, veroorzaken epizoötie in de populaties van verschillende plaagsoorten³. De soorten EPF zijn gastheerspecifiek en vormen relatief weinig risico’s in termen van het aanvallen van niet-doelsoorten, en ze zijn niet giftig voor het milieu⁴. EPF heeft een uniek mechanisme voor het binnendringen van hun gastheer, evenals voor het verspreiden en volharden in hun directe omgeving¹. Ze vallen de gastheer voornamelijk aan via aseksuele sporen die zich hechten aan en doordringen in de nagelriem van de gastheer om binnen te dringen en zich te vermenigvuldigen in de gastheerhemocoel. De gastheer sterft uiteindelijk als gevolg van uitputting van de hemolymfe voedingsstoffen of als gevolg van de toxemie veroorzaakt door de toxische metabolieten die door de schimmel worden vrijgegeven. Na de dood, onder ideale omgevingsomstandigheden, komt de schimmel tevoorschijn op het buitenoppervlak (openlijke mycose) van het gastheerkadaver ^5,6.

Groeiende bezorgdheid over de negatieve effecten van chemische residuen op de menselijke gezondheid, milieuvervuiling en de ontwikkeling van resistentie tegen plagen hebben geleid tot de wereldwijde drang om de input van insecticiden op chemische basis te verminderen en alternatieve, nieuwe en duurzame strategieën voor gewasbescherming en ongediertebestrijding te vinden ^6,7,8 . Dit heeft mogelijkheden geboden om microbiële insecticiden te ontwikkelen voor gebruik in Integrated Pest Management (IPM) -programma’s, die ecologisch gunstiger strategieën zijn dan conventionele chemische bestrijding ^3,8.

Om een succesvol microbieel bestrijdingsmiddel voor een landbouwplaag te ontwikkelen, moet eerst een geschikt organisme worden geïsoleerd, gekarakteriseerd, geïdentificeerd en de pathogeniciteit ervan voor het doelorganisme worden bevestigd. Een eenvoudige, kosteneffectieve methode voor grootschalige productie van het microbiële agens is echter vereist om een levensvatbaar product te produceren voor gebruik in biologische bestrijdingsprogramma’s 9,10,11,12,13. Massaproductie van aanzienlijke hoeveelheden entomopathogenen van goede kwaliteit is afhankelijk van de microbiële stam, het milieu, de doelplaag, de formulering, de markt, de toepassingsstrategie en het gewenste eindproduct 14,15,16. EPF kan in massa worden geproduceerd met behulp van vloeibare substraatfermentatie om blastospores te produceren of het fermentatieproces van vaste substraten om luchtconidia ^6,17,18 te produceren. Het massaproductie- en formuleringsproces van entomopathogenen heeft echter een directe invloed op de virulentie, de kosten, de houdbaarheid en de veldeffectiviteit van het eindproduct. Voor succesvol gebruik in IPM moet het productieproces van de entomopathogenen gemakkelijk te uitvoeren zijn, minimale arbeid vereisen, een hoge opbrengstconcentratie van virulente, levensvatbare en persistente propagules produceren en goedkoop zijn 4,13,14,16.

Het begrijpen van de voedingsbehoeften van entomopathogenen is belangrijk voor massateelt met alle kweekmethoden ^4,12. De voedingscomponenten van het productiemedium hebben een aanzienlijke invloed op de eigenschappen van de resulterende propagules, waaronder biocontrole-werkzaamheid, opbrengst, uitdrogingstolerantie en persistentie 8,19,20,21. De optimalisatie van productieprocedures is ontworpen om dergelijke factoren aan te pakken²². Voor EPF zijn de belangrijkste vereisten voor goede groei, sporulatie en massaproductie van schimmelconidia voldoende vocht, optimale groeitemperatuur, pH, gasuitwisseling van CO₂ en O₂ en voeding, waaronder goede fosfor-, koolhydraat-, koolstof- en stikstofbronnen¹⁸.

Jaronski en Jackson¹⁸ beschrijven de vaste substraatfermentatiemethode als de meest efficiënte en de dichtstbijzijnde benaderingsmethode voor het natuurlijke proces voor EPF-productie ten opzichte van de vloeibare substraatfermentatiemethode, omdat onder natuurlijke omstandigheden het schimmelconidium wordt gedragen op vaste rechtopstaande structuren, zoals het oppervlak van insectenkadavers. Landbouwproducten en bijproducten die zetmeel bevatten, worden meestal gebruikt voor de massaproductie van hypocrealean schimmels, omdat de schimmels zetmeel gemakkelijk ontbinden door afscheiding van sterk geconcentreerde hydrolytische enzymen uit hun hyphale uiteinden, om de vaste stof binnen te dringen en om toegang te krijgen tot de voedingsstoffen die aanwezig zijn in de stof 11,17,18,23 . De graanproducten bieden ook de vereisten voor een gezonde biomassaproductie, omdat, wanneer ze worden gehydrateerd en gesteriliseerd, de substraten verdere voedingsstoffen uit elk vloeibaar medium kunnen opnemen 16,18,24.

Eerder probeerden verschillende studies EPF-soorten zoals Beauveria bassiana (Bals. Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas en enkele van de Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin soortencomplex isoleert op verschillende substraten 16,23,24. Dergelijke in massa geproduceerde en commercieel ontwikkelde isolaten omvatten Green Muscle^® (stam IMI 330189), ontwikkeld uit M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 stam ICIPE69), en Real Metarhizium 69 (L9281), ontwikkeld uit M. anisopliae, en Breedband^® (stam PPRI 5339) en Eco-Bb^®, ontwikkeld uit B. bassiana^25.26 . Er zijn echter beperkte pogingen gedaan om Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber en Metarhizium pinghaense Chen & Guo te masseren. Deze twee isolaten werden in een eerdere studie geselecteerd als de meest effectieve voor de bestrijding van de wolluis, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. Daarom was de huidige studie gericht op het formuleren en massaal produceren van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van de lokale isolaten van M. robertsii pt M. pinghaense voor commerciële toepassing tegen insectenplagen. De vaste substraatfermentatiemethode werd gebruikt om de schimmelconidia voor beide EPF-isolaten massaal te produceren. Twee EPF-inentingsmethoden, met behulp van conidiale suspensies en de vloeibare schimmelcultuur van blastospores, werden gebruikt om de vaste substraten te enten.

Protocol

1. Bron van schimmelstammen Gebruik Zuid-Afrikaanse geïsoleerde schimmelstammen van zowel M. pinghaense 5 HEID (GenBank Toetredingsnummer: MT367414/MT895630) als M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), verzameld uit appelboomgaarden in de provincie West-Kaap, Zuid-Afrika. Kweekculturen van elk EPF-isolaat op 60 g Sabouraud dextrose-agarmedium, aangevuld met 1 g gistextract (SDAY) en 10 μL streptomycine.OPMERKING: Incubeer EPF-culturen bij een gecontro…

Representative Results

Een afname van de inhoudsmassa van de culturen op rijst voor zowel de M. pinghaense als de M. robertsii werd in de loop van de tijd waargenomen tijdens het droogstadium van de schimmelculturen, waarbij geen of weinig verandering werd waargenomen in de massa zodra de culturen droog waren (figuur 5). Het geoogste droge schimmel conidia poeder van zowel de M. pinghaense als de M. robertsii is weergegeven in figuur 6. <p class…

Discussion

De succesvolle integratie van microbiële agentia voor de biologische bestrijding van belangrijke landbouwinsectenplagen in een agro-ecosysteem hangt af van zowel succes als gemak van massaproductie van de entomopathogenen als eerste stap onder laboratoriumomstandigheden. De massaproductie van EPF is belangrijk voor de grootschalige toepassing en beschikbaarheid van EPF-producten voor IPM-programma’s met behulp van biologische bestrijding 9,10,11,12,13.^</sup…

Materials

0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia